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曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、Morris水迷宮注意缺陷多動(dòng)障礙大鼠模型的建造

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、Morris水迷宮注意缺陷多動(dòng)障礙大鼠模型的建造

【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/b>:探討曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱、Morris水迷宮注意缺陷多動(dòng)障礙大鼠模型的建造技術(shù)。

【方法】:204周齡SD大鼠隨機(jī)分成模型組和對(duì)照組,模型組自由飲用0.2 mg/mL醋酸鉛溶液。28 d后運(yùn)用開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮、Lat迷宮觀(guān)察兩組大鼠行為學(xué)表現(xiàn);采用ICPMS檢測(cè)大鼠血鉛濃度、酶聯(lián)**吸附測(cè)定法法(ELISA)測(cè)定大鼠血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量。

【結(jié)果】:模型組在開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中大鼠穿越格子數(shù)、直立次數(shù)增多(P < 0. 05 ) ,Lat迷宮中直立次數(shù)及穿越角落的時(shí)間比例增加(P< 0. ,05),Morris水迷宮口標(biāo)象限停留時(shí)間縮短(P <0.05);模型組大鼠血鉛濃度高于對(duì)照組(P < 0. 05 ) ,血清多巴胺和去甲腎上腺素含量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)

【結(jié)論】:采用自由飲用0. 2 mg/mL醋酸鉛溶液法成功建造了ADHD大鼠模型,具有ADHD基本臨床特征,可做為ADHD的動(dòng)物模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

【關(guān)鍵詞】注意缺陷多動(dòng)障礙模型;醋酸鉛;SD大鼠;行為學(xué)檢測(cè);多巴胺;去甲腎上腺素

    兒童注意缺陷多動(dòng)障礙(ADHD)簡(jiǎn)稱(chēng)兒童多動(dòng)癥,在兒童青少年精神心理**中具有代表性,其主要表現(xiàn)為自主活動(dòng)增多、學(xué)習(xí)記憶能力下降、注意力不集中等。ADHD的病因和發(fā)病機(jī)制尚不確定,目前認(rèn)為本病是由多種生物因素、心理和社會(huì)因素所致的一種綜合征。在ADHD的病因?qū)W調(diào)查中,外部環(huán)境因素對(duì)其影響占有絕大部分,特別是**生活環(huán)境和有害物質(zhì)的暴露,對(duì)正處于成長(zhǎng)發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期的青少年有巨大的影響。本文以少量鉛暴露建造ADHD大鼠模型,并從行為學(xué)和生化學(xué)兩個(gè)方而對(duì)其進(jìn)行評(píng)估。

【1材料與方法】

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組20SD大鼠,4周齡,雄性,SPF級(jí)(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部),許可證號(hào):SCXK()20110012。實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)3d后,隨機(jī)分為A,B兩組(即模型組和對(duì)照組)5/(鼠籠25 cm x 45 cm x15 om),明暗交替比12: 12 h (7: 0019 : 00),室溫2022 0C ,濕度適宜,大鼠自由進(jìn)食和飲水。

1. 2實(shí)驗(yàn)方法

1. 2. 1大鼠模型建造采用0. 2 mg/mL的醋酸鉛溶液自由飲用法建造模型,對(duì)照組自由飲用蒸餾水,余其同。

1.2.2行為學(xué)檢測(cè)

1. 2. 2. 1開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn):開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)及開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱由上海欣軟信息科技有限公司提供。開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)箱由醫(yī)用有機(jī)板制成,規(guī)格為50 cm X 50 cm X 50 cm,采用九宮格為測(cè)試基底。測(cè)試前1d將大鼠放入開(kāi)場(chǎng)箱10 min適應(yīng)環(huán)境,以減少大鼠對(duì)陌生環(huán)境產(chǎn)生的焦慮而影響其活動(dòng)水平,實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)將大鼠輕輕放入中央格子,在光亮條件下,通過(guò)視頻分析系統(tǒng)自動(dòng)記錄大鼠5 min內(nèi)的活動(dòng)情況,記錄大鼠穿越的格子數(shù)、直立次數(shù)、理毛次數(shù)以及糞便數(shù)。測(cè)試期間保持周邊光線(xiàn)和噪聲的一致性。


1.2.2.2 Morris水迷宮測(cè)試:Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)由上海欣軟信息科技有限公司提供,Morri s水迷宮箱體(箱體由直徑155 cm,高50 cm灰白色鐵皮圓形蓄水池及同顏色平臺(tái)構(gòu)成),池內(nèi)水深25 cm,水溫22-24 0C。將水池平均分為一、二、三、四四個(gè)象限,平臺(tái)頂端平面面積為8 cm X 8 cm,訓(xùn)練期間迷宮外參照物的位置保持不變。將大鼠置于一個(gè)象限內(nèi),距圓心21 cm,距池壁20 cm,隱沒(méi)于水而下1.5 cm(訓(xùn)練期間平臺(tái)位置不變)。第1d不設(shè)立平臺(tái),讓大鼠進(jìn)入水池自由游60 s進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練。從第2d開(kāi)始連續(xù)Sd隨機(jī)地從四個(gè)不同象限讓大鼠進(jìn)入水中,大鼠入水尋找并逃避到平臺(tái)。

視頻分析軟件記錄大鼠從入水到找到平臺(tái)所需時(shí)間(潛伏期),若在120 s內(nèi)大鼠無(wú)法找到平臺(tái),則由檢測(cè)者引導(dǎo)其上平臺(tái)。所有大鼠上臺(tái)后均停留10 s,以利于其對(duì)空間參照物的記憶。第6d去掉平臺(tái),讓大鼠在水中游泳120 s,記錄大鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)、在原來(lái)平臺(tái)所在象限所停留的時(shí)間及路程,以此評(píng)價(jià)動(dòng)物對(duì)己獲取信息的存儲(chǔ)、記憶能力。

 

1. 2. 2. 3  Lat迷宮:Lat迷宮實(shí)驗(yàn)箱為一個(gè)40 cm x 60 cm x 60 cm的木箱,中間放置一個(gè)30 cmx 30 cm的透明有機(jī)玻璃箱,從而產(chǎn)生一個(gè)寬15 cm、長(zhǎng)60 cm、高40 cm的通道,根據(jù)視頻分析軟件分析記錄觀(guān)察大鼠穿越角落的時(shí)間和直立次數(shù),作為對(duì)環(huán)境刺激的非選擇性注意水平的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.3生化指標(biāo)測(cè)定

1. 2. 3. 1血鉛濃度的測(cè)定3. 0%****鈉腹腔注射麻醉大E (40 mg/kg),腹主動(dòng)脈采l(TL 2. 5 mL于肝素抗凝管中待查;2 mL全血于消解罐中,加8 mL濃硝酸冷消化1 h,按優(yōu)化程序進(jìn)行微波消解,電熱板160℃趕酸后,用2. 0 %硝酸定容到25 mL,搖勻待測(cè)。采用電感藕合等離子體質(zhì)譜法(ICPMS)測(cè)定全血中鉛含量。

1.2.3.2血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量測(cè)定3. 0%****鈉腹腔注射麻醉大鼠(40 mg / kg)后,腹主動(dòng)脈采血4 mL于非抗凝管中,靜置3h,離心10 min (3 000rpm),取上清1 mL,分裝到兩個(gè)EP管中,于一80℃保存?zhèn)溆谩4笫笱逯卸喟桶泛腿ゼ啄I上腺素含量測(cè)定:采用北京利維寧生物科技有限公司提供的大鼠多巴胺和去甲腎上腺素酶聯(lián)**分析(ELISA)試劑盒。

1. 3統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17. 0統(tǒng)計(jì)軟件,進(jìn)行兩獨(dú)立樣本資料檢驗(yàn)

【2結(jié)果】

2. 1大鼠行為學(xué)指標(biāo)檢測(cè)

2.1.1開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較模型組大鼠在開(kāi)場(chǎng)試驗(yàn)中表現(xiàn)大鼠活動(dòng)能力的穿越格子數(shù)、直立次數(shù)較對(duì)照組大鼠增多,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05),而理毛次數(shù)和糞便數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05)。見(jiàn)表1

 

 

2.1.2   Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較模型組與對(duì)照組大鼠在連續(xù)Sd的定位航行實(shí)驗(yàn)中找到平臺(tái)的時(shí)間(潛伏期)隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行逐日遞減,但是比較總體學(xué)習(xí)成績(jī)?cè)趦山M間差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P >0.05),見(jiàn)圖1;在第6d的探索實(shí)驗(yàn)中,模型組大鼠穿越原平臺(tái)所在位置的次數(shù)與對(duì)照組沒(méi)有差異(P >0.05),但在目標(biāo)象限停留的時(shí)間和游程比例較對(duì)照組大鼠縮短,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見(jiàn)表2

 

 

2. 1. 3   Lat迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Lat迷宮中,模型組大鼠總的直立次數(shù)及穿越角落的時(shí)間比例都高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)。見(jiàn)表3

 

 

2. 2生化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)與對(duì)照組相比,模型組大鼠血鉛濃度增加(P <0.05),且模型組大鼠血清中多巴胺和去甲腎上腺素的含量降低,差異有顯著性(<0.05)。見(jiàn)表4

 

3討論

    動(dòng)物**模型主要用于實(shí)驗(yàn)生理學(xué)、實(shí)驗(yàn)病理學(xué)和實(shí)驗(yàn)**學(xué)(包括新藥篩選)研究。**的發(fā)**展十分復(fù)雜,以人本身作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象探討**發(fā)生機(jī)制,對(duì)推動(dòng)醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展來(lái)之緩慢,且臨床經(jīng)驗(yàn)的積累不僅在時(shí)間和空間上存在局限性,而且在道義和方法上也受到限

制。借助動(dòng)物模型的間接研究,可以有意識(shí)地改變自然條件下不可能或不易排除的因素,更準(zhǔn)確地觀(guān)察結(jié)果,方便、有效地認(rèn)識(shí)人類(lèi)**的發(fā)**展規(guī)律,研究防治措施。

    適宜的動(dòng)物模型,有助于ADHD的臨床干預(yù)**和實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究,闡明ADHD的發(fā)病機(jī)制和**的作用機(jī)理,同時(shí)也為ADHD**的預(yù)防干預(yù)探索新的思路。目前,關(guān)于ADHD動(dòng)物模型的建立均以模仿ADHD的某一臨床表現(xiàn)為主要依據(jù),從遺傳、神經(jīng)發(fā)育及社會(huì)應(yīng)激等多個(gè)層而建立模型。其中利用自然和人工培育的遺傳突變體構(gòu)建的SHR大鼠模型*為接近ADHD的表現(xiàn),能夠持續(xù)性的表達(dá)ADHD的一些基本特征,常被用于ADHD

的干預(yù)和**研究。其他的模型多是從ADHD的影響因素及發(fā)病機(jī)理來(lái)探討并建立,如尼古丁ADHD模型、社會(huì)隔離ADHD模型、基因缺失ADHD模型等。理想的ADHD動(dòng)物模型應(yīng)該具有:(1)模擬ADHD基本的臨床行為特征;(2)精神興奮劑****有效;(3)吻合臨床提出的一些合理的病理生理學(xué)假設(shè);(4)對(duì)ADHD在行為、遺傳、神經(jīng)化學(xué)和**等方而研究提供預(yù)測(cè)作用;(5)能重復(fù)再現(xiàn),操作簡(jiǎn)單,成功率高,能便于推廣應(yīng)用。

    鉛為環(huán)境中不可降解的有毒重金屬,一直被認(rèn)為是ADHD的環(huán)境影響因素之一,流行病學(xué)研究己經(jīng)提供了有力證據(jù)表明即使在低濃度血鉛水平,生命早期鉛暴露會(huì)影響發(fā)育中的大腦。鉛暴露的兒童成年后智力下降,表現(xiàn)出認(rèn)知缺陷。

    本次研究中,采用自由飲用0. 2 mg/mL醋酸鉛溶液來(lái)復(fù)制大鼠ADHD模型,通過(guò)開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、Morris水迷宮、Lat迷宮等行為學(xué)檢測(cè),結(jié)合血鉛濃度、血清多巴胺和去甲腎上腺素含量變化等生化學(xué)指標(biāo)對(duì)對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果顯示:模型組大鼠血鉛含量明顯高于對(duì)照組,表明實(shí)驗(yàn)中鉛染毒成功,是導(dǎo)致ADHD的**誘因。從行為學(xué)檢測(cè)指標(biāo)來(lái)看,模型組大鼠在開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中的直立次數(shù)、穿越格子數(shù)以及Lat迷宮實(shí)驗(yàn)中直立次數(shù)、穿越角落停留時(shí)間較對(duì)照組增加,表明ADHD模型大鼠自發(fā)活動(dòng)水平以及非選擇性注意水平增加,驗(yàn)證了鉛暴露ADHD模型大鼠具備ADHD的多動(dòng)和注意缺陷的臨床特點(diǎn);Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中模型大鼠在目標(biāo)象限停留時(shí)間和游程所占時(shí)間比例較對(duì)照組大鼠明顯縮短,提示ADHD模型大鼠的記憶能力減退,進(jìn)一步驗(yàn)證了鉛暴露ADHD模型大鼠具備ADHD的臨床特點(diǎn),該結(jié)論與Clements KM等的研究結(jié)果一致。由于ADHD的發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān),因此我們進(jìn)一步檢測(cè)了大鼠的血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量,ADHD模型大鼠的血清中多巴胺和去甲腎上腺素含量明顯低于對(duì)照組,表明鉛可降低體內(nèi)多巴胺和去甲腎上腺素水平,使得該模型更具ADHD的臨床特征。

    本次實(shí)驗(yàn)采用4周齡的SD大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,是由于4周齡的大鼠相當(dāng)于人類(lèi)的兒童期,而大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)與近似于人類(lèi),常被用做實(shí)驗(yàn)室研究。采用自由飲用0.2 mg/mL醋酸鉛溶液來(lái)進(jìn)行大鼠鉛染毒法制備ADHD模型,在一定程度上模擬兒童鉛污染過(guò)程。可見(jiàn)本實(shí)驗(yàn)的擬ADHD大鼠模型建造成功,為今后兒童注意缺陷多動(dòng)障礙的防治干預(yù)研究奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

 

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