三箱社交行為對自閉癥大鼠病癥行為的改善作用

摘要：

目的探討三箱社交行為、自發活動實驗對自閉癥大鼠病癥行為的改善作用及相關機制。

方法采用丙戊酸鈉( sodium valproate VPA)一次性腹腔注射孕12.5 d大鼠制備自閉癥幼大鼠模型，雷帕霉素處理組于VPA注射后每天給大鼠口服4 mg/kg雷帕霉素直至斷奶。將出生幼鼠分為4組:對照組，VPA處理組，雷帕霉素處理組與VPA聯合雷帕霉素處理組。在幼鼠出生后35 d進行社會交往行為檢測、神經行為學檢測，并分離提取腦組織蛋白通過Western blot分析mTOR磷酸化水平及自噬標志蛋白LC3表達情況;電鏡分析前額葉組織中自噬小體形成情況。結果成功制備自閉癥大鼠模型。與對照相比，VPA處理組社會交往能力下降、在中央區活動時間增加、站立次數減少(P <0.05)，符合自閉癥行為特征;雷帕霉素單獨處理組無明顯行為學變化;但雷帕霉素聯合處理能明顯改善VPA處理導致的自閉癥行為癥狀(P <0.05) o  Western blot結果顯示，與對照組相比，VPA處理可增強大鼠前額葉、海馬及小腦組織中mTOR磷酸化水平，并降低LC3-II表達水平;而雷帕霉素聯合處理則能抑制上述腦組織中mTOR的磷酸化并增強LC3-II表達水平。電鏡分析結果表明，VPA處理可減少幼鼠前額葉組織中的自噬小體，而雷帕霉素聯合處理則能明顯增加自噬小體的形成。

結論雷帕霉素可改善自閉癥模型大鼠的病癥行為，機制可能與抑制mTOR活性并增強細胞自噬相關。

關鍵詞：三箱社交行為;自閉癥;自噬；自發活動

    自閉癥(autism)又稱兒童孤獨癥，是以嬰幼兒期就表現出交往障礙、語言障礙和(或)重復刻板行為為主要臨床特征的一種腦發育障礙綜合征，其發病率為2 / 1 000 } 6 / 1 000 }'}。目前我國約有60多萬自閉癥兒童，男孩多于女孩，并且發病率還呈上升趨勢[}z}。自閉癥的發病原因復雜，涉及遺傳、**、環境、飲食、教育等多個方面，至今尚未完全闡明[3]。

    研究表明，Tscl基因敲除小鼠具有自閉癥類似癥狀，但詳細的分子機制尚不明確[#]。由于Tscl基因是Akt-mammalian target of rapamycin  ( mTOR)信號通路的重要中間分子[[5]，該基因缺失后會導致mTOR活性升高，進而引起細胞內多種代謝途徑的改變，尤其是細胞自噬被抑制。因此本課題組設想mTOR活性升高導致的細胞自噬水平下降可能是引起自閉癥發病的重要原因。為證明這一假說，本研究以自閉癥大鼠為模型，觀察腦組織中細胞自噬水平變化情況，并探討mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)對自閉癥大鼠病癥行為的改善作用。

材料與方法

1.1實驗動物

    本實驗所用Wistar大鼠由第三軍醫大學實驗動物中心提供。成年清潔級Wistar雄性大鼠(體質量300-350 g) 12只，雌性大鼠(體質量200一250 g) 12只，飼養于第三軍醫大學實驗動物中心。

1.2藥品及試劑、實驗儀器

    丙戊酸鈉( sodium valproate，VPA) , LC3抗體購自Sigma公司，磷酸化mTOR抗體、GAPDH抗體購自CellSignaling公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒和細胞裂解液購自江蘇碧云天生物技術公司，PVDF膜購自美國Bio}ad公司，蛋白Marke:購自北京中衫公司。三箱社交行為實驗系統由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號：XR-XJ117，自發活動系統由上海欣軟信息科技有限公司提供，型號：XR-XZ301。

1.3動物模型制備與分組

    參照Sehneider等的方法，將雌、雄大鼠合籠過夜，次日早晨對雌鼠進行**涂片檢查，發現陰栓者記為妊娠第1天(E1)，并將孕母鼠單獨飼養。將孕鼠分為4組，分別為對照組、VPA處理組(即模型組)、雷帕霉素處理組及VPA聯合雷帕霉素處理組，每組3只。

VPA處理組與VPA聯合雷帕霉素處理組在E12. 5 d時給孕鼠腹腔注射VPA，劑量為600 mg/kg;同時給對照組與雷帕霉素處理組孕鼠腹腔注射等量的生理鹽水;雷帕霉素處理組及VPA聯合雷帕霉素處理組在E12. 5 d后每天給孕鼠口服雷帕霉素(4 mg/kg)直至仔鼠斷奶，其他小組口服等劑量溶劑(麻油)。VPA處理組孕鼠產下的仔鼠即為孤獨癥模型組，而對照組孕鼠產下的仔鼠為正常對照組。幼鼠出生后第1天記為P1。各組幼鼠統一于出生后23 d (P23 )斷奶。

1.4社會交往行為檢測

在幼鼠出生后35 d，分別從每組各選擇6只進行檢測。檢測鼠均為雄性，出生時間相差不超過1d，體質量差別小于15 g，分籠飼養。檢測在大小為60 cm x60 cm x 60 cm的透明三室箱內進行。實驗前1d，所有被檢測鼠放入檢測室適應環境。實驗時將1只被測鼠放入中間小室先適應10 min。然后在左側小室放置空鐵絲籠子，右側小室放入陌生幼鼠并用同樣的鐵絲籠子罩住。打開中間小室進入左、右小室的通道，攝像記錄10 min內被檢測鼠的行為，通過Supermaze軟件系統分別統計被檢測鼠自梳理(非社交行為)、嗅鐵絲籠子和陌生鼠(社交行為)時間。

1.5神經行為學檢測

    同樣在幼鼠出生后35 d檢測，分別從模型組與對照組各選擇5只進行檢測，被檢測大鼠的選擇標準同1.4。檢測在大小為25 cm x 25 cm x 38 cm的封閉箱內進行，箱子中央12 cm x 12 cm區域為中央區。實驗前1d，所有被檢測鼠放入檢測室適應環境。檢測時將被檢測鼠放入檢測箱中央，攝像記錄5 min內被檢測鼠的行為，通過Supermaze軟件系統分別統計被檢測鼠在中央區活動時間及直立次數。

1.6Western blot檢測

    將出生后35 d的幼鼠斷頸處死，立即分離前額葉皮層、海馬和小腦組織。將各組織分別按100 mg/mL比例加入組織裂解液進行勻漿。冰上靜置30 min后于4 0C 12 000 r/min離心30 min。取上清，測定蛋白濃度后置一80℃冰箱備用。將含50 ug總蛋白的組織樣品經SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后轉移到PVDF膜上。經5%脫脂奶粉封閉后加入一抗4℃孵

育過夜，PEST洗滌后再加入二抗，室溫孵育1h。再經PEST漂洗后加入化學發光液進行曝光顯影。

1.7電鏡分析

    將出生后35 d的幼鼠斷頸處死，立即分離前額葉皮層、海馬和小腦組織。將各組織分別進行固定、塊染、脫水、浸透、包埋后切片，置于銅網上進行透射電鏡觀察。全部樣品處理過程及觀察、拍照均在第三軍醫大學中心實驗室完成。

1.8統計學分析

  采用SPSS 19. 0統計軟件進行數據分析，所有數據均用x士s表示，均數比較采用單因素方差分析。

2結果

2. 1雷帕霉素處理顯著改善自閉癥大鼠的社會交往能力

社會交往實驗分析發現，與對照組相比，VPA處理組幼鼠社會交往能力顯著下降(P <0.05)，體現為自我梳理時間增加，不愿意與陌生幼鼠交往，不愿接觸新事物，符合自閉癥兒童的行為特點。雷帕霉素單獨處理組幼鼠與對照組相比社會交往能力無顯著差異;而雷帕霉素聯合處理則可以改善VPA處理導致的社會交往能力下降(P <0.05，圖1) 。

2. 2雷帕霉素處理明顯改善自閉癥大鼠的神經病征行為

2. 2. 1雷帕霉素處理減少自閉癥幼鼠在中央區活動時間如圖2所示，對照組正常幼鼠在中央區活動時間較短，而VPA處理組幼鼠在中央區活動時間明顯增加，與對照組存在明顯差異(P <0.05)，符合自閉癥的行為特點。雷帕霉素單獨處理組幼鼠與對照組相比活動方式無顯著差異;而雷帕霉素聯合處理則可以減少自閉癥幼鼠在中央區活動時間(P <0.05)，明顯改善自閉癥幼鼠的活動方式。

2. 2. 2雷帕霉素處理增加自閉癥大鼠站立次數

如圖3所示，正常對照組幼鼠的站立次數顯著高于VPA處理組的自閉癥模型鼠(P <0.05)，而雷帕霉素聯合處理則可以明顯增加自閉癥幼鼠的站立次數(P<0. 05 )。

2. 3雷帕霉素處理增強自閉癥大鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織的自噬水平

分別分離各組幼鼠的前額葉皮層、海馬和小腦組織進行Western blot分析。如圖4所示，與正常對照組相比，VPA處理組自閉癥幼鼠的前額葉皮層、海馬和小腦組織中的mTOR蛋白磷酸化明顯增強，而雷帕霉素可以特異性抑制mTOR蛋白磷酸化。對自噬標志性蛋白LC3-II的水平進行分析發現，VPA處理組LC3-II水平明顯降低(P<0.05)，表明在自閉癥幼鼠的腦組織中自噬被抑制。使用雷帕霉素處理后，可以明顯增加自閉癥幼鼠前額葉皮層、海馬和小腦組織中LC3-II的水平(P < 0. OS )，促進自噬發生。對LC3-II的水平進行定量分析也進一步支持了這一結果。

為進一步證實自噬在雷帕霉素改善自閉癥幼鼠病癥行為中的作用，對幼鼠前額葉組織中的自噬小體進行電鏡觀察，結果見圖5。從圖5可看出，正常幼鼠前額葉組織中存在少量自噬小體(箭頭所示),VPA處理組則觀察不到自噬小體的存在，而雷帕霉素處理組及VPA聯合雷帕霉素處理均存在大量自噬小體。這一結果說明雷帕霉素處理確實可以增加自閉癥幼鼠腦組織中的自噬水平。

3討論

在針對自閉癥的研究過程中，學者們建立了多種自閉癥動物模型，如Tscl基因敲除鼠模型、病毒感染模型、VPA**處理模型等。在這些模型中，VPA一次性注射**模型是目前公認的一種較理想的自閉癥動物模型。該模型可以在行為上模擬自閉癥的刻板、重復等行為特征，且腦組織中的神經形態變化也與自閉癥尸檢報告也相似。社會交往實驗是測驗模型動

物社會交往能力的經典實驗，實驗中的陌生鼠與空籠子分別代表了新伙伴與新事物，通過分析規定時間內被檢測鼠自我梳理、與陌生鼠及空籠子的接觸時間，從而判斷其社會交往能力。在本研究中，經VPA處理的模型鼠社會交往能力明顯減弱，與自閉癥癥狀相符。

神經行為學檢測實驗中，在中央區所呆時間長短反映了被測動物的空間認知能力，正常鼠對明亮、開放的新環境具有先天的躲避傾向，喜歡避開中央區、在四周角落中探尋，而對新環境認知能力差的自閉癥鼠則停留在中央區的時間就會延長;站立次數反映了被測鼠在新環境中的探索能力，正常鼠站立次數多、探索能力強，而自閉癥鼠則站立次數減少、探索能力減弱。本研究中VPA處理的自閉癥模型鼠也具有相似的行為特征。VPA誘導大鼠發生自閉癥的藥理機制目前尚不明確。本實驗結果表明，VPA可以增強大鼠前額葉、海馬與小腦組織中的mTOR磷酸化，從而增強mTOR活性，并抑制自噬的標志性蛋白LC3-II的生成以及自噬小體的形成，這與TSC基因敲除自閉癥模型鼠中mTOR的活性增強具有相似性，表明這可能是VPA誘導自閉癥發生的重要機制。

    雷帕霉素是一種新型大環內酷類**抑制劑。研究表明，在帕金森、亨廷頓病等神經退行性**動物模型中，雷帕霉素對神經元細胞均具有保護作用。在外傷性腦組織損傷動物模型中雷帕霉素處理也可以減少神經細胞的損害。但目前尚未見雷帕霉素處理改善自閉癥癥狀的相關報道。雷帕霉素在細胞內的特異性分子靶點是mTOR，雷帕霉素可以特異性抑制mTOR的磷酸化并抑制其活性。本實驗結果也表明，雷帕霉素處理后大鼠前額葉皮質、海馬及小腦組織中mTOR磷酸化水平明顯降低，mTOR活性明顯下降。由于mTOR是調節細胞內代謝的關鍵分子，尤其與細胞自噬的發生密切相關，因此，雷帕霉素處理后神經組織中自噬水平的增加可能是其改善自閉癥癥狀的重要機理。

    自噬是細胞中降解長壽命蛋白與細胞器并回收利用相關降解產物的重要分解代謝機制，在細胞的生長、發育與**的發生中發揮重要作用。自噬水平的降低是多種神經退行性**如帕金森病、阿爾茨海默病、亨廷頓病等發病的重要原因。盡管自噬與自閉癥的發病關系目前尚少見報道，但在多種自閉癥模型動物中均發現了與自噬發生相關的信號通路的改變。如自閉癥模型動物腦組織中Wnt信號通路的增強,TSC基因敲除自閉癥模型鼠腦組織中mTOR信號通路的激活等，均可降低細胞中的自噬水平。由于mTOR通路是自噬發生的關鍵性上游通路，抑制該通路后可顯著增強細胞內的自噬水平，因此本實驗選用mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素來抑制該通路并進而增強神經細胞中的自噬水平。實驗結果也證實這一策略具有可行性，從而為自閉癥的**提供了一定的理論與實驗依據。