[摘要] 目的: 優(yōu)選三七葉總皂苷的酶解工藝并評價其酶解產(chǎn)物的抗抑郁活性。方法: 以人參皂苷類成分的轉化率為指標,通過單因素試驗優(yōu)選三七葉總皂苷的酶解工藝。建立小鼠慢性溫和性不可預知應激模型評價酶解產(chǎn)物的抗抑郁活性。結果: 選擇蝸牛酶為轉化酶,酶解 pH 4. 5,溫度 50 ℃,時間 12 h,人參皂苷類成分的轉化率達 50%。小鼠建模 6 周后,呈現(xiàn)出體重下降、快感缺失、行動遲緩等抑郁癥相似行為,表明建模成功。第 7 ~9 周給藥期內給藥組小鼠體重及糖水偏好率顯著增加,自主活動水平亦有一定程度的改善。第 9 周時與模型組相比,酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組、氟西汀組小鼠的體重分別增加了 9. 33%,12. 44%,18. 13%,15. 03%; 糖水偏好率分別提高了 22. 64%,19. 87%,19. 38%,20. 85%; 自主活動水平分別提高了 8. 35%,41. 30%,13. 33%,12. 06%,其中酶解產(chǎn)物中劑量組呈現(xiàn)極顯著性差異。結論: 三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物對抑郁小鼠模型具有良好的抗抑郁作用。
[關鍵詞] 三七葉總皂苷; 人參皂苷類成分; 酶解產(chǎn)物; 慢性溫和性不可預知應激模型; 抑郁癥; 單因素試驗
三 七 葉 總 皂 苷 為 五 加 科 植 物 三 七 Panaxnotoginseng ( Burk. ) F. H. Chen 葉子的提取物,為傳統(tǒng)中成藥七葉神安片的主要原料,具有****、**止痛的功效。文獻報道人參總皂苷具有明顯的抗抑郁作用,其有效成分包括人參皂苷Rb1和人參皂苷 C-K,前期研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rb3亦具有顯著的抗抑郁活性。由于人參皂苷 Rb1,Rb3均為三七葉總皂苷的主要成分,故推測三七葉總皂苷具有抗抑郁活性。研究表明人參皂苷類成分會在動物胃腸液及腸內菌的作用下產(chǎn)生系列代謝產(chǎn)物而發(fā)揮藥理藥效作用,體外研究表明酶解法可適當降解三七葉總皂苷而獲得較多的次級皂苷或者皂苷元,故推測三七葉總皂苷的體外酶解產(chǎn)物具有較好的抗抑郁作用。本實驗擬制備三七葉總皂苷的酶解物,采用小鼠慢性溫和性不可預知應激模型初步評價其抗抑郁活性,為基于三七葉總皂苷為原料的抗抑郁新藥的開發(fā)提供參考。自發(fā)活動曠場實驗抗抑郁活性評價
1 材料
LC-10A 型高效液相色譜儀 ( 日本島津公司) ,202A1 型數(shù)顯電熱恒溫干燥箱( 上海錦屏儀器儀表公司) ,XR-XZ301型自發(fā)活動實驗裝置及視頻分析系統(tǒng)( 上海欣軟信息科技有限公司) 。三七葉總皂苷( 廣東環(huán)球制藥有限公司) ,人參皂苷 Rb1,Rb2,Rb3對照品( 均購自中國食品藥品檢定研究院,批號分別為 110704-200318,111715-200802,111686-200501) ,人參皂苷 C-K,Rh2,Rc 及原人參二醇對照品( 均購自南京澤朗醫(yī)藥有限公司,批號分別為39262-14-1-100312,78214-33-22000103,11021-14-0-100507,7755-01-3-100414) ,蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶、B-葡聚糖酶( 北京諾唯信公司) ,鹽酸氟西汀膠囊( 上海中西制藥有限公司) ,D101 型大孔樹脂( 山東魯抗樹脂廠) ,甲醇為色譜純,水為蒸餾水,其他試劑均為分析純。NIH 小鼠,18 ~ 22 g,SPF 級,雄性,購自廣東省實驗動物中心,許可證號 SCXK( 粵) 2008-0002。
2 方法與結果
2. 1 酶解條件的優(yōu)化 以人參皂苷類成分的轉化率接近 50% 為目標,通過單因素試驗優(yōu)選酶解的pH、溫度和時間等參數(shù),人參總皂苷含量以三七葉總皂苷中人參皂苷 Rb1,Rb2,Rc,Rb3含量總和標示。轉化率 = ( 1 - 酶解后人參總皂苷含量/酶解前人參總皂苷含量) ×100%
2. 1. 1 酶的種類 精密稱取三七葉總皂苷 4 份,每份 4 g,分別溶解于 100 mL 磷酸鹽緩沖液( pH 4. 5)中,80 ℃水浴加熱 30 min( 消除其他酶的影響) ,冷卻至室溫,依次加入蝸牛酶、纖維素酶、果膠酶、B-葡聚糖酶0. 5 g 溶解,50 ℃水浴12h,自來水冷卻至室溫停止反應,濃縮,干燥,即得酶解物樣品,測定三七葉總皂苷酶解前后人參總皂苷含量。結果發(fā)現(xiàn)采用蝸牛酶酶解時,人參總皂苷含量明顯減少,而采用其自發(fā)活動曠場實驗抗抑郁活性評價他酶酶解時人參總皂苷含量變化不大。
2. 1. 2 酶解 pH 精密稱取三七葉總皂苷 7 份,每份 4 g,分別溶解于 100 mL 不同 pH( 3. 0,3. 5,4. 5,5. 5,6. 5,7. 5,8. 0) 的磷酸鹽緩沖液中,80 ℃ 水浴加熱30 min,冷卻至室溫,各加入蝸牛酶 0. 5 g,其他操作同 2. 1. 1 項,計算人參總皂苷轉化率分別為15. 34% ,24. 74% ,47. 38% ,39. 23% ,20. 54% ,11. 03% ,3. 66% ,表明隨著 pH 的增大,轉化率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,在偏酸性條件下酶解效果較好,確定酶解 pH 4. 5。
2. 1. 3 酶解溫度 精密稱取三七葉總皂苷 5 份,每份 4 g,分別溶解于 100 mL pH 4. 5 的磷酸鹽緩沖液中,80 ℃水浴加熱 30 min,冷卻至室溫,各加入蝸牛酶 0. 5 g,在不同水浴溫度下( 40,50,60,70,80 ℃)反應 12 h,其他操作同 2. 1. 1 項,計算人參總皂苷轉化率分別為 23. 96%,54. 88%,63. 42%,44. 68%,11. 06% ,說明溫度過高可能會導致酶失活,綜合考慮,確定酶解溫度 50 ℃。
2. 1. 4 酶解時間 精密稱取三七葉總皂苷 5 份,每份 4 g,分別溶解于 100 mL pH 4. 5 的磷酸鹽緩沖液中,80 ℃水浴加熱 30 min,冷卻至室溫,各加入蝸牛酶0. 5 g,依次于50 ℃水浴中反應 6,9,12,15,18 h,其他操作同 2. 1. 1 項,計算人參總皂苷轉化率分別為30. 78%,42. 61%,53. 75%,64. 11%,83. 72%,故確定酶解時間 12 h。
2. 2 酶解產(chǎn)物的富集純化
采用樹脂法富集純化酶解產(chǎn)物中的人參皂苷類成分,酶解產(chǎn)物用水溶解,以 2 BV·h
- 1的流速通過預處理好的 D-101 型大孔樹脂柱內進行吸附,加 3 BV 水以 4 BV·h- 1的流速洗脫雜質,用 90% 乙醇 4 BV 洗脫,收集乙醇洗脫液,濃縮,干燥,即得。
2. 3 酶解產(chǎn)物的含量測定 人參皂苷 Rb1,Rb2,Rc,Rb3的含量測定方法參照文獻。酶解產(chǎn)生的原人參二醇、人參皂苷 Rh2和人參皂苷 C-K 的HPLC 測 定 條 件 為 Ultimate AQ-C18色 譜 柱( 4. 6 mm × 250 mm,5 μm) ,流動相甲醇-水( 86 ∶
14) ,流速 0. 7 mL·min- 1,柱溫 25 ℃,檢測波長 203nm,進樣量 10 μL。結果顯示三七葉總皂苷中人參皂苷 Rb1,Rc,Rb2,Rb3,Rh2,C-K 及原人參二醇的質 量 分 數(shù) 分 別 為 3. 78% ,9. 35% ,3. 46% ,18. 58% ,1. 26% ,0. 66% ,0. 89% ,而 酶解產(chǎn)物中上述成分的質量分數(shù)則分別為 2. 62% ,5. 89% ,
1. 37% ,8. 12% ,8. 73% ,4. 32% ,5. 67% 。酶解產(chǎn)物經(jīng)過樹脂純化后轉移率達 86. 37% 。三七葉總皂苷酶解后人參皂苷 Rb1,Rb2,Rc,Rb3的質量分別減少了 40. 14% ,45. 59% ,65. 80% ,62. 25% ,而微量的人參皂苷 Rh2,C-K 和原人參二醇則明顯增加,表明三七葉總皂苷經(jīng)蝸牛酶水解后,人參皂苷類成分發(fā)生了一定程度的降解,生成相應的次級皂苷或皂苷元。
2. 4 抗抑郁活性評價
2. 4. 1 建模方法
每天隨機給予小鼠任意一種刺激( 行為限制 30 min,4 ℃ 冰水游泳 2 min,斷水24 h,斷糧 24 h,夾尾 5 min,通宵照明,白噪音30 min及 45 ° 斜籠等) ,使小鼠不能預料刺激的發(fā)生,在建模前及建模后每隔 1 周進行行為學指標測定,以判斷慢性溫和性不可預知應激模型( CMS) 是否建模成功。
2. 4. 2 動物分組及給藥 小鼠隨機分為空白組,模型組,人參皂苷 Rb3組,氟西汀組,酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組共 7 組。建模成功后,人參皂苷 Rb3組按40 mg·kg- 1給予人參皂苷 Rb3溶液,氟西汀組按10 mg·kg- 1給予氟西汀溶液,酶解產(chǎn)物低、中、高劑量組分別按 20,40,80 mg·kg- 1給藥,空白組和模型組小鼠給予等劑量蒸餾水,連續(xù)給藥 3 周。
2. 4. 3 慢性應激建模及**對小鼠體重的影響分別在造模前 1 d( 0 周) 、造模期( 第 1 ~6 周) 及給藥期( 第 7 ~ 9 周) 測定小鼠體重,觀測小鼠體重變化情況,結果見表 1。建模前 1 周為小鼠適應期,各組間小鼠無顯著性差異; 第 1 ~2 周時各組小鼠體重均有所增加,但各組間無顯著性差異; 第 3 ~ 6 周空白組小鼠體重持續(xù)增加,模型組及各給藥組小鼠體重則持續(xù)減少,與空白組相比具有顯著性差異( 0 ~
4 周試驗數(shù)據(jù)省略) 。第 6 周時,與空白組相比,模型組、人參皂苷 Rb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組小鼠體重分別降低了 16. 44%,16. 00% ,16. 00% ,16. 89% ,16. 00% ,17. 33% ,慢性應激導致小鼠體重的明顯減少表明建模成功。第7 ~ 9 周為給藥期,除模型組外,其余 6 組小鼠體重呈明顯增加趨勢。在第9 周時,人參皂苷 Rb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組與模型組相比,小鼠體重分別增加了 9. 84%,15. 03%,9. 33% ,12. 44% ,18. 13% ,均具有極顯著性差異; 但與空白組相比,小鼠體重分別降低了 12. 03%,7. 88% ,12. 45% ,9. 96% ,5. 39% ,均具有顯著性差異,表明各給藥組小鼠給藥 3 周后,小鼠體重雖能顯著提高,但不能恢復至正常水平。在第 7 ~9 周的給藥期內,給予人參皂苷 Rb3和氟西汀后可極顯著地恢復小鼠體重,表現(xiàn)出明顯的抗抑郁作用; 而三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物則呈現(xiàn)較低劑量發(fā)生抗抑郁作用的時間較長,高劑量起效較快的特點。
2. 4. 4 慢性應激建模及**對小鼠糖水消耗的影響 CMS 小鼠會出現(xiàn)快感缺失現(xiàn)象,通常以糖水偏好率行為學指標來測定小鼠快感缺失的程度,同時可反映各給藥組的抗抑郁藥效。建模前對小鼠糖水消耗基線進行測定,結果空白組、模型組、人參皂苷Rb3組、氟西汀給藥組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高)劑量 組 的 糖 水 消 耗 量 分 別 為 ( 6. 82 ± 0. 497) ,( 6. 92 ±0. 462) ,( 6. 78 ± 0. 447) ,( 6. 87 ± 0. 359) ,( 6. 69 ±0. 765) ,( 6. 89 ± 0. 554) ,( 6. 85 ± 0. 571)
g,各組間無顯著性差異,表明可以進行糖水消耗試驗。采用雙瓶法,試驗前斷水24 h,分別給予2 個已稱重的喂水瓶,一瓶為 1% 蔗糖水,一瓶為自來水,24 h 后分別稱定 2 個水瓶的質量,按糖水偏好率 =蔗糖瓶飲用量/( 蔗糖瓶飲用量 + 自來水瓶飲用
量) ×100%計算,見表 2。結果顯示建模第 1 ~4 周各建模組小鼠的糖水偏好率均有一定下降,但與空白組相比無顯著性差異,故試驗數(shù)據(jù)省略; 在第 5 周時,各建模組小鼠的糖水偏好率下降至約 68. 5%,與空白組相比下降明顯,但仍無顯著性差異; 建模第6 周時各建模組小鼠的糖水偏好進一步下降,與空白組相比,模型組、人參皂苷Rb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn) 物 不 同 ( 低、中、高) 劑 量 組 分 別 降 低 了12. 98% ,11. 44% ,13. 24% ,16. 07% ,16. 32% ,11. 57% ,均具有顯著性差異,表明建模成功。第7 ~ 9周為給藥期,與模型組相比,第 7 周時氟西汀給藥組小鼠糖水偏好率明顯提高了 23. 30%,而酶解物產(chǎn)物不同劑量組和人參皂苷 Rb3組小鼠則無明顯影響; 第8 周時人參皂苷 Rb3組、氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組小鼠的糖水偏好率較模型 組 分 別 提 高 了 25. 09%,26. 19%,21. 95%,
23. 19% ,21. 06% ,均具有極顯著性差異,第 9 周時上述各給藥組的糖水偏好率分別提高了 15. 47%,20. 85% ,22. 64% ,19. 87% ,19. 38% ,同樣具有極顯著性差異,逆轉了 CMS 小鼠的快感缺失現(xiàn)象,表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用。在第 7 周時,給予氟西汀后可馬上恢復 CMS 小鼠的快感缺失行為,起效較快,而三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物及人參皂苷 Rb3在第 8,9周時才發(fā)揮作用,呈現(xiàn)起效較慢的特點。
2. 4. 5 慢性應激建模及**對小鼠自主活動的影響 將小鼠放入 ZH-ZFT 型自發(fā)活動實驗裝置中,適應 2 min,錄像記錄小鼠在隨后 5 min 內的活動總路程,使用附帶的分析系統(tǒng)對錄得結果進行分析。在建模前及建模 1 ~ 4 周時,各給藥組、模型組和空白組間均無顯著性差異,但各給藥組、模型組和空白組的自主活動總路程均呈現(xiàn)較明顯的下降趨勢,試驗數(shù)據(jù)省略,建模第 5 ~9 周時小鼠自主活動記錄見表 3。第 5 ~6 周時,各給藥組、模型組和空白組小鼠的自主活動總路程繼續(xù)呈現(xiàn)較明顯的下降趨勢,但各給藥組、模型組和空白組間依然無顯著性差異,表明長期飼養(yǎng)及慢性應激可降低小鼠的自主活動水平。第 7 ~9 周為給藥期,第 7 周時各組小鼠的自主活動水平進一步下降,但無顯著性差異; 第 8 ~ 9 周給藥后,各給藥組小鼠的自主活動水平呈現(xiàn)明顯的恢復趨勢,與模型組相比,第 9 周時氟西汀組及酶解產(chǎn)物不同( 低、中、高) 劑量組小鼠的自主活動水平分別提高了 12. 06%,8. 35%,41. 30%,13. 33%,表明各給藥組的自主活動水平有一定程度的改善。自發(fā)活動曠場實驗抗抑郁活性評價
3 討論
三七葉總皂苷含有人參皂苷 Rb1,Rb2,Rc,Rb3等成分,預試驗對不同酶解程度的三七葉總皂苷產(chǎn)物進行篩選,結果發(fā)現(xiàn)人參皂苷類成分的轉化率接近 50%時,酶解產(chǎn)物的抗抑郁活性*佳。CMS 是抑郁癥研究中常用的動物抑郁模型,可模擬人類抑郁癥中體重下降、快感缺失、自主活動下降等核心癥狀。NIH 小鼠建模 6 周后,呈現(xiàn)出體重下降、快感缺失、行動遲緩等抑郁癥相似的行為表現(xiàn),說明建模成功; 在第 7 ~9 周給藥期內,三七葉總皂苷酶解產(chǎn)物能恢復小鼠的體重,提升小鼠的糖水偏好率,緩解小鼠快感缺失情況,恢復小鼠自主活動水平,表明酶解產(chǎn)物具有良好的抗抑郁作用。抑郁癥作為慢性**,需要長期服藥,故必須要考慮抗抑郁藥的長期耐受性和與其他**相互作用的**性等問題。目前,主流的抗抑郁西藥如氟西汀、帕羅西汀、西酞普蘭等雖然起效快,但由于化學結構特征和作用機制的特點,不可避免地會產(chǎn)生 5-HT 綜合征、胃腸道反應、性功能障礙、抗****異常分泌綜合征、戒斷反應等**反應。三七葉總皂苷作為**補腦藥用于精神科**已有多年,**可靠,毒副作用少,至今未發(fā)現(xiàn)**反應的報道,因此,以三七葉總皂苷為原料開發(fā)療效顯著、低毒、**的人參皂苷類抗抑郁新藥具有重要意義。