【摘 要】 目的: 探討慢性應激性刺激引起的抑郁狀態對大鼠海馬神經元再生的影響。方法: 建立大鼠慢性應激性抑郁癥模型，通過開場實驗和蔗糖飲水實驗觀察大鼠行為學變化; 取大鼠腦冰凍切片行 Doublecortin ( DCX)**熒光檢測海馬新生神經元。結果: 慢性應激抑郁模型大鼠開場實驗水平運動得分和垂直運動得分降低，蔗糖偏嗜度降低，且體重明顯減輕; **熒光結果顯示慢性應激抑郁模型大鼠海馬齒狀回顆粒下層( subgranularzone SGZ) DCX 陽性細胞減少。結論: 慢性應激性刺激引起的抑郁狀態下大鼠海馬神經元再生能力減弱，提示海馬神經元再生的損害可能參與了抑郁癥的病理過程。

【關鍵詞】 慢性應激性刺激; 抑郁癥; 模型; 海馬; 神經元再生

抑郁癥是一種常見的情感性精神障礙，具有較高的復發率和終生患病率，但其發病機制目前尚不明確。慢性不可預知性應激性刺激( chronic un-predictable stress，CUS) 是近年來國內外用于抑郁癥動物模型制作方法之一，目前被廣泛運用于抑郁癥的病理生理機制研究。研究表明慢性應激性刺激能引起大腦器質性損害，尤其是海馬結構和功能的損害，因此可誘發抑郁癥狀的發生。另外，神經系統的可塑性和神經細胞順應性的損害也參與了抑郁癥的發病過程。海馬作為介導應激反應的重要腦區，也是大腦可塑性極易受損的一個腦區，因而在研究抑郁癥病因和發病機制中占有重要地位。

本文采用慢性不可預知性應激刺激的方法建立大鼠抑郁癥模型，利用開場實驗和蔗糖飲水實驗觀察大鼠行為學變化，同時通過**熒光法觀察大鼠海馬齒狀回神經元再生，探討慢性應激抑郁狀態對大鼠海馬神經元再生的影響，從而為抑郁癥發病機制的研究提供實驗證據。

材料和方法

1 材料

1． 1 實驗動物 36 只成年 SD 雄性大鼠，SPF 級，購入時體重 200 ～ 220 g，購自南通大學動物實驗中心。實驗前在安靜的環境下適應性飼養 1 周，大鼠每籠 4 只群養，自由攝食飲水，室溫 22 ～24℃，相對濕度( 50 ±10) %，自然晝夜節律性光照。

1． 2 大鼠慢性應激抑郁模型的建立 36 只大鼠被隨機分為兩組: ①正常對照組 16 只: 正常飲水進食，不給任何刺激。②慢性應激模型組 20 只: 給予慢性不可預知的刺激。由于機體對單一應激原的刺激易產生耐受性，因此本實驗采用多種不可預知的刺激

方式交替進行，建立大鼠慢性不可預知性應激模型。慢性應激時程共計 5 周，應激方式如下: ①食物剝奪( 禁食) ，12 h; ②禁水，12 h; ③夾尾( 距尾根1 cm 夾

閉) ，1 min; ④噪音刺激( 110 dB) ，1 h; ⑤傾斜飼養( 傾斜 45 度) ，12 h; ⑥ 通宵照明，12 h; 以上應激方式每天隨機使用一種，但禁水、禁食隔開進行。

2 方法

2． 1 行為學檢測 開場實驗( Open-field) 所用敞箱為高 40 cm、長寬均為 80 cm 內空的立柱體，周壁為黑色，底面用白線劃分為面積相等的 25 塊。以動物穿越底面方塊數作為水平活動( crossing) 得分，以直立次數為垂直活動( rearing) 得分。每只動物僅進行一次測定，每次 5 min。行為評定采用盲法，在安靜房間內，由三名觀察者進行，取三人的各指標平均值作為實驗大鼠原始的行為學數據。蔗糖飲水實驗步驟如下: 應激刺激結束后，讓各組動物任意飲用兩瓶不同的水: 其中一瓶為含 1%蔗糖的自來水、一瓶為自來水。測試下午 4∶ 00 至**天上午 8∶ 00 自來水和蔗糖水的飲用量( 通過稱飲水瓶重量) ，以蔗糖偏嗜度( saccharose preference) 表示，蔗糖偏嗜度/% = 蔗糖水飲用量/( 蔗糖水飲用量+ 自來水飲用量) ，作為衡量標準。比較不同組蔗糖偏嗜度的變化。

2． 2 **熒光雙標檢測 各組大鼠經麻醉、開胸，用生理鹽水 100 ml 及 4% 多聚甲醛的 0． 1 mol/LPBS( pH 7． 2) 400 ml 經心灌注，取腦。后固定 4 h，蔗糖平衡沉底，冰凍切片機冠狀切片，片厚 30 μm，從海馬開始處出現收集切片，切片漂于 0． 01 mol/LPBS( pH 7． 2) 中。切片用 0． 01 mol/L PBS( pH 7． 2) 漂洗，經 10%山羊血清封閉過夜。每張切片滴加小鼠抗 DCX 的單克隆抗體( 1∶ 1000，Abcam 公司) 50 μl，4℃濕盒孵育 24 h。用 0． 01 mol/L PBS( pH 7． 2) 漂洗 3 遍后，

在避光條件下，每張切片滴加山羊抗小鼠**抗體( 1∶ 50，Chemicon 公司) ，4℃濕盒孵育 24 h。在避光條件下，PBS 洗片 3 遍后，每張切片滴加 Hoechst33342 染液 50 μl( 1∶ 1500，Sigma 公司) ，室溫下避光振搖30 min 后，PBS 漂洗3 遍，中性甘油封片。先后在激發光波長為 495 nm、吸收光波長為 520 nm，激發光波長為346 nm、吸收光波長為460 nm 的熒光顯微鏡下觀察 DCX/Hoechst 陽性細胞并攝片。

2． 3 圖像處理與統計學分析 拍攝的熒光照片通過 Leica Qwin plus 軟件行 DCX、Hoechst 熒光雙標圖片的合成。在低倍視野( ×10) 下計數海馬齒狀回內DCX 陽性細胞，在高倍視野( × 40) 下測量 DCX 陽性細胞胞體周長和突起長度。以均數 ± 標準差( x珋 ± s)表示其數量，并采用 spss11 統計軟件行單因素方差分析( one-way ANOVA) 。P ＜0． 05 為具有統計學意義。

結 果

1 大鼠行為學檢測

1． 1 體重和開場行為指標比較 實驗之前，兩組動物在體重、水平穿越格數( Crossing) 、直立次數( Ｒea-ring) 上相比無差異( P ＞ 0． 05) 。而在 28 天之后，實驗組與對照組相比，實驗組體重低于對照組( P ＜0． 01) ，實驗組水平穿越格數減少( P ＜ 0． 01) ; 直立次數減少( P ＜0． 01，表 l，Fig． 1) 。

2 **熒光雙標檢測

呈綠色熒光的 DCX 陽性細胞主要分布在大鼠海馬齒狀回顆粒下下層( SGZ) 區，胞漿和突起均顯綠色。模型組大鼠 SGZ 區 DCX 陽性細胞分布稀疏，明顯少于對照組 SGZ 區 DCX 陽性細胞數目。但模型組 SGZ 區多數 DCX 陽性細胞胞體較大，突起長，而對照組 SGZ 區 DCX 陽性細胞以胞體小，短突起細胞為主( Fig． 2) 。兩者比較結果為模型組 DCX 陽性細胞平均胞體周長( μm) 為 201． 36 ±16． 12 高于對照組 134． 81 ±15． 45，P ＜0． 01; 模型組 DCX 陽性細胞突起平均長度為 26． 74 ±6． 33 長于對照組 14． 20± 5． 06，P ＜ 0． 01。慢性應激抑郁狀態對大鼠海馬神經元再生的影響

討 論

在本研究中建立大鼠抑郁模型主要采用輕度、不可預見的應激性刺激長期作用于大鼠，使其產生抑郁癥狀，這與人類抑郁癥中慢性、低水平的應激原促進**發生、加速**發展的機理相似。實驗組大鼠經過 35 d 的慢性應激性刺激，與對照組相比開場活動減少，表明抑郁模型大鼠緊張程度增加、興趣喪失和認知能力的減退。實驗組大鼠對糖水適應減少反映了模型大鼠的興趣和欲望的缺失，這也與臨床抑郁癥患者所表現的精神運動改變、興趣或快感的喪失等有很大程度的相似性。從大鼠體重的變化來看，經過慢性應激后大鼠體重較對照組明顯減輕，這也與臨床抑郁癥病人的體重變化相符合，表明本實驗中大鼠抑郁癥模型的制作是成功的。

目前研究認為抑郁癥發**展與神經系統可塑性損傷有關，有文獻報道慢性應激可導致海馬出現多種可塑性損害的表現: 海馬體積減小，CA3 區錐體細胞萎縮，數目減少，齒狀回顆粒細胞增生抑制，同時伴有學習、記憶和情緒反應的缺陷。在實驗中，我們發現慢性應激抑郁模型大鼠海馬齒狀回SGZ 區 DCX 陽性細胞數減少，而且均為胞體較大，且突起長的成熟細胞，表明在 SGZ 區神經元前體細胞減少，尤其是新生神經元前體細胞數目下降明顯，這可能是慢性應激狀態下海馬齒狀回顆粒細胞增生抑制的可能機制。眾所周知海馬齒狀回顆粒下層是成年哺乳動物腦內神經元再生的重要區域，位于SGZ 區的神經干細胞會向神經元前體細胞方向分化，新生神經元前體細胞不斷成熟并逐漸遷移到顆粒層接受或投射纖維到 CA3 區。因此，位于 SGZ區的神經元前體細胞減少可能是抑郁模型大鼠 CA3區錐體細胞萎縮，數目減少的根本原因。有報道稱給予抗抑郁類**氟西汀、氟伏沙明和三環類去甲丙米嗪，使海馬 CA3 區和齒狀回的樹突棘濃度顯著增加，表現出對海馬神經元的正性營養作用。表明抗抑郁藥僅能改善癥狀而不能逆轉病程，因為受到損害的海馬神經元沒有得到有效的補充。

一般來說，SGZ 區 DCX 陽性細胞數目下降的原因主要有三種可能: SGZ 區神經干細胞增殖抑制; 神經干細胞向神經元前體細胞分化抑制; 新生神經元前體細胞存活率下降，或者多種因素綜合作用的結果。不同類型的刺激對于海馬新生神經元的影響，以及其中的分子機制還有待于在今后的實驗中進一步闡明，通過補充新生神經元減少慢性應激所致的海馬可塑性損害將為臨床**抑郁癥以及其它應激相關性精神障礙提供新的**思路。