摘要：目的 探討鷹嘴豆異黃酮提取物(CIE)對阿爾茨海默病(AD)炎癥模型大鼠記憶能力的影響，并探討其可能的作用機制。方法 采用脂多糖右側海馬注射制備 AD 模型，40 只 Wistar 大鼠隨機分為 CIE 高、中、低劑量組(100，50，25 mg·kg-1)、模型組和對照組(生理鹽水)，灌胃給藥 28 d 后，采用 Y-迷宮測試大鼠的學習記憶能力，采用**組化法檢測大鼠海馬內腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和細胞白介素-6(IL-6)的表達。結果 與對照組比較，模型組大鼠學習記憶能力明顯下降，嘗試次數均明顯增加(P<0.01)，TNF-α 和 IL-6 的表達水平有顯著提高(P<0.01)；經過灌胃給藥不同劑量的 CIE 后，與模型組相比，大鼠學習記憶的嘗試次數和 TNF-α、IL-6 的表達水平有不同程度的降低，并呈現一定的劑量依賴性，特別在中、高劑量組差異具有統計學意義(P<0.05 或 P<0.01)。結論 CIE 對 AD 模型大鼠的學習記憶能力有明顯的改善作用，其作用機制Y迷宮對大鼠學習記憶能力表達的影響

可能與抑制模型大鼠海馬組織內 TNF-α 和 IL-6 的表達有關，進而抑制海馬神經元的炎癥反應。

關鍵詞：鷹嘴豆異黃酮提取物；阿爾茨海默病；腫瘤壞死因子-α；細胞白介素-6；海馬

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種起病隱匿的進行性發展的神經系統退行性**，其病因和發病機制十分復雜。有證據顯示，在 AD 發病初期及病程進展過程中，海馬的形態結構、神經病理會發生一系列的變化，并在 AD 的發病與發展中具有重要作用。**神經系統的炎癥反應是 AD 的關鍵性特征之一，所涉及的多種炎性細胞因子加速了 AD 的整個病變過程，因此有研究提出，****可能延緩神經元退行性病變的速度，或將有利于緩解 AD 患者的癥狀。鷹嘴豆 Cicer arietinum L.屬于豆科，味甘、性平、無毒，具有補中**、溫腎**、潤肺止咳等功效。有研究表明，鷹嘴豆具有廣泛的藥理活性，包括保護心血管、抗腫瘤、調脂等功能，這與其含有的活性成分異黃酮有著密切的關系，如芒柄花黃素、雞豆黃素 A。更有研究顯示，鷹Y迷宮對大鼠學習記憶能力表達的影響豆 異 黃 酮 提 取 物 (Cicer arietinum isoflavoneextract，CIE)可改善 D-半乳糖衰老模型小鼠的學習記憶能力，其作用機制與其抗氧化能力有關。而 CIE 是否能通過影響 AD 病程的炎癥反應及炎癥因子的表達，從而緩解 AD 的癥狀，國內外文獻未見報道。本實驗旨在觀察 CIE 對 AD 模型大鼠學習記憶能力的影響，并探討其可能的機制，為抗 AD 的**研發提供實驗依據和新的研究思路。

1 材料

1.1 動物

成年 Wistar 大鼠 40 只，♂，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證號：SCXK(滬)2012-0002，清潔級，體質量 200~250 g。

1.2 藥品、試劑與儀器

CIE 為自行制備，紫外分光光度法測得異黃酮含量為 39.0%；脂多糖(Sigma 公司，批號：B5-L2880)，用生理鹽水配成 5 μg·μL-1的溶液；TNF-α(批號：20130917)、IL-6(批號：20131025)、非結合多克隆兔抗體(批號：20131025)、S-P 試劑盒(批號：20130818)及 DAB 顯色試劑盒(批號：20120320)均購自武漢博士德生物工程有限公司；UV-3100 紫外可見分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)； XR-XY1031 Y-迷宮刺激器(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠腦立體定位儀(美國 Stoelting 公司)；JD801 圖像分析儀(江蘇捷達科技公司)。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

將 Wistar 大鼠，♂，隨機分為 5 組：CIE 高、中、低劑量組(100，50，25 mg·kg-1)、模型組和對照組，每組 8 只，安靜清潔環境下 4 只一籠飼養，溫度控制在(25±1)℃，相對濕度 60%，正常飲食。造模手術后第 2 天開始，各試驗組均灌胃給藥進行干預，每日 1 次，模型組和對照組給予等量的生理鹽水。

2.2 模型制備

采用 2%****鈉(40~50 mg·kg-1)腹腔注射對大鼠進行麻醉，將其固定于腦立體定位儀上，剪去頭頂部毛發，碘酊**后切開皮膚，參照《大鼠腦立體定位圖譜》選擇右側側腦室為注射靶區，于前囟后 1.0 mm，中線旁開 1.6 mm 處，用柔性顱骨鉆鉆開顱骨，暴露硬腦膜，用微量注射器緩慢自腦表面垂直進針 3.4 mm，將 5 μg·μL1的脂多糖溶液緩慢注入，2 min 后將注射針緩慢抽出，用骨蠟封住鉆孔，縫合切口。對照組注射等量的生理鹽水。

2.3 Y-迷宮學習記憶能力測試

大鼠連續灌胃給藥 28 d 后，采用 Y-型迷宮測試大鼠的學習記憶能力。實驗分 2 次進行，每次測試固定在上午 8：00~12：00，測試環境應保持安靜，避光。第 1 次為學習能力測試：訓練前，將大鼠放入 Y-迷宮自由活動適應 5 min，適應后將Ⅰ臂作為**臂，Ⅱ、Ⅲ臂給予 60 V，0.5~0.7 mA的電刺激，持續 2 s，以大鼠被電擊后一次性逃離至**臂為正確反應，否則判定為錯誤反應。之后的訓練將**臂作為起始臂，將大鼠放置于**臂 1 min 加強記憶，**臂按照Ⅰ→Ⅱ→Ⅲ→Ⅰ的順序依次改變，其他臂再次給予電刺激，依次類推，以測試達到連續 10 次中有 9 次正確反應所需的電擊次數作為評價大鼠學習能力的指標。第 2次為記憶能力測試：學習能力測試后 48 h 后，以同樣的方法測試，以測試達到連續 10 次中有 9 次正確反應所需的電擊次數作為評價大鼠記憶能力的指標。

2.4 取材方法和樣品制備

在 Y-型迷宮學習記憶能力測試后，用 2%****鈉(40~50 mg·kg-1)腹腔注射對大鼠進行麻醉，麻醉后剪開胸腔，使心臟暴露，將灌流針從大鼠的左心室插入至升主動脈，剪開右心耳，并同時快速灌注 37 ℃的生理鹽水至流出液清亮，然后用4%多聚甲醛溶液灌注固定 1 h。灌注結束后迅速端頭取腦，去除嗅球和小腦，將組織放入 4%多聚甲醛溶液中進行后固定 6 h。固定后修腦，取包含海馬組織的腦區經梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋后，切片備用，厚度為 4 μm。

2.5 大鼠海馬內 TNF-α 和 IL-6 表達的檢測

大鼠海馬內 TNF-α 和 IL-6 表達的檢測，按照博士德生物工程有限公司提供的**組化試劑盒說明書進行操作。切片制作完成后，每張切片隨機觀察 5 個高倍視野下的海馬區域，根據 TNF-α和 IL-6 蛋白的表達，利用生物醫學圖像分析系統對視野進行灰度值測定并記錄結果

2.6 統計學分析

計量資料以 x ± s表示，采用 SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析。2 組間的比較采用 t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析及 Dunnett’s 檢驗。

3 結果

3.1 CIE 對 AD 模型大鼠 Y-迷宮學習記憶能力的影響

在學習能力測試中，與對照組相比，模型組大鼠所需要的嘗試次數明顯增加(P<0.01)，說明造模成功的 AD 大鼠學習能力降低。而灌胃給予不同劑量的 CIE 后，嘗試次數均有所下降，并呈現一定的劑量依賴性，中、高劑量組的差異具有統計學意義(P<0.05 或 P<0.01)。同樣在記憶能力測試中，模型組大鼠所需的嘗試次數明顯高于對照組(P<0.01)，與模型組比較，不同劑量 CIE 組的嘗試次數均有所下降，50 和 100 mg·kg-1劑量組的差異具有統計學意義(P<0.01)，且具有一定的劑量相關性。Y迷宮對大鼠學習記憶能力表達的影響

3.2 CIE 對 AD 模型大鼠海馬內 TNF-α 和 IL-6 表達水平的影響

經圖像分析系統測試顯示，模型組大鼠海馬內 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值顯著低于對照組(P<0.01)，提示模型組大鼠海馬內 TNF-α 和 IL-6的表達呈現強陽性；CIE 各劑量組 TNF-α 和 IL-6的平均灰度值相對于模型組有一定的提高，說明TNF-α 和 IL-6 的表達降低，且差異在 CIE 中、高劑量組中具有統計學意義(P<0.05 或 P<0.01)。結果見表 2。

4 討論

AD 發病機制雖然復雜，但目前學界公認炎性反應在 AD 的發病過程中起著重要的作用。有國外研究顯示，大量 TNF-α 等炎性細胞因子會存在AD 的神經病例過程中，異常高度表達的 TNF-α提示其可能與 AD 的發病有關。IL-6 是一種炎癥性細胞因子，處于 AD **神經系統炎癥反應的中心位置，參與 AD 患者炎癥級聯反應的形成。Sokolova 等通過大量試驗表明，IL-6 在 AD 患者腦組織中呈顯著上調趨勢，認為 IL-6 具有神經元毒性作用，參與 AD 的發病過程。與對照組相比，本研究中的模型組大鼠學習記憶的嘗試次數明顯增加(P<0.01)，海馬內 TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值顯著降低(P<0.01)，提示表達呈現強陽性，說明AD 模型大鼠學習記憶能力顯著降低，**神經系統炎癥反應明顯，進一步證明了該模型的可靠，可以用于炎癥反應介導的 AD 研究。鷹嘴豆由于富含具有較強抗氧化活性的異黃酮類化合物，近幾年成為天然抗氧化劑開發的研究熱點。有研究表明，CIE 可能通過抗氧化機制改善 D-半乳糖致衰老模型小鼠的學習記憶能力，而氧化應激不僅直接參與了 AD 的發病機制，更重要的是通過其連接中介效應放大了 AD 神經炎性病變的發生。本研究結果顯示，CIE 各劑量組TNF-α 和 IL-6 的平均灰度值相對于模型組有一定的提高，提示海馬內 TNF-α 和 IL-6 的表達降低，并呈現一定的劑量依賴性，且差異在 CIE 中、高劑量組中具有統計學意義(P<0.05 或 P<0.01)。說明 CIE 對海馬組織神經膠質細胞的活化增生及TNF-α、IL-6 等炎癥因子的產生有一定的抑制作用，在一定程度上阻斷了 AD 模型大鼠海馬內的炎癥損傷，而產生一定的保護作用。然而，CIE 是通過何種機制和通路對 TNF-α、IL-6 等炎癥因子起

到精準調控，需要進一步地深入研究和探討?？傊?，CIE 對 AD 模型大鼠學習記憶障礙有一定的改善作用，其作用機制可能與抑制大鼠海馬組織內 TNF-α 和 IL-6 的表達有關，并進而抑制海馬神經元的炎癥反應。