摘要: 目的 研究糖尿病發展過程中大鼠血漿 β-淀粉樣蛋白 42( amyloid beta 42，Aβ42) 、胰島素和血糖的動態變化; 初步探討在糖尿病發展過程中胰島素和血糖對 Aβ42 的影響，并分析糖尿病發展成為認知障礙的風險。方法 腹腔注射鏈脲佐菌素( streptozotocin，STZ) 復制實驗性糖尿病大鼠模型，以血糖濃度≥16. 7 mmol·L－ 1確定模型成立。實驗分為正常組與模型組。建模前后共采集5 次血液，每次間隔 15 d。建模 60 d，代謝籠測大鼠 24 h 食量、水量、尿量和糞便量; 建模 70 d，八臂迷宮實驗測定大鼠覓食時間、參考記憶錯誤次數和工作記憶錯誤次數。用葡萄糖氧化酶法和酶聯**吸附法測血糖、胰島素和 Aβ42 的含量。結果 STZ 復制的糖尿病大鼠模型穩定。模型組大鼠食量、水量、尿量和糞便量明顯高于對照組( P ＜0. 01) ; 八臂迷宮實驗: 與對照組比較，模型組大鼠覓食時間、參考記憶錯誤頻率和平均探究時間均有顯著性差異( P ＜0. 05) ，工作記憶錯誤頻率高于對照組，但是無統計學意義。模型成立初期 Aβ42 隨胰島素增多而降低，建模 45 d，Aβ42 含量*高，之后下降。結論 建模70 d，模型組大鼠學習記憶能力明顯低于對照組，糖尿病大鼠患認知障礙的風險明顯增高; 糖尿病初期，模型成立 45 ～ 75 d，為給予**干預**的*佳時期; 臨床上可以通過同時檢測胰島素和 Aβ42 判斷糖尿病是否向認知障礙發展。

關鍵詞: 糖尿病; β-淀粉樣蛋白 42; 胰島素; 血糖; 認知障礙; 動態變化

近年來，糖尿病的發生率正以驚人的速度上升。根據世界衛生組織( WHO) 報道，2006 年全世界約有 1. 8 億人患糖尿病，2007 年糖尿病患者人數增長到 2. 46 億，如不進行干預，這一數字到2030 年可能會增加一倍以上。目前我國糖尿病患病人數已經超過 7000 萬，成為繼腫瘤、心血管病之后的第三大嚴重威脅人們健康的慢性**。然而，全球超過 20 萬人患有老年癡呆癥，到2040 年這一數字預計將超過 80 萬。*近的一些證據表明，糖尿病和阿爾茨海默氏病( AD) 間有密切的關系。糖尿病被認為是患老年癡呆癥包括阿爾茨海默氏病的一個危險因素。然而，這一風險的分子機制還不是很清楚。*近的幾項研究結果表明，胰島素和葡萄糖代謝紊亂增加患癡呆癥的風險，特別是在 AD 患者中。腦脊液( cerebrospinal fluid，CSF) 中 β-淀 粉 樣 蛋 白( amyloid beta，Aβ) 的水平檢測對診斷 AD 的價值已被廣泛證實，其診斷 AD 的準確率可達 80% ～90%。Aβ 的聚集和沉積在 AD 的發病過程中具有重要作用，并且 Aβ42 是聚集和沉積的核心。一些證據表明，胰島素和 Aβ 同時競爭胰島素降解酶( insulin degrading enzyme，IDE) ，并且 IDE 通過其他多肽底物優先結合胰島素;另一方面，胰島素和影響胰島素水平的因素可能循環調解 Aβ 水平，并且 Aβ42 是 Aβ 聚集的核心。在臨床上，被診斷為 AD 患者的病程是不可逆的，無法**，并且在發生 AD 的過程中首先出現認知功能下降，發生認知障礙是共性。因此，早期識別促進 AD 患者發病的病理，對降低 AD 的發展率是必要的。新進研究報道，糖尿病發生時，血糖和胰島素代謝紊亂，促進 AD 的發生，但是在糖尿病發展到什么程度才能促進 AD 發生的連續研究至今未見報道。因此作者在本實驗中選擇糖尿病大鼠作為研究對象，觀察在糖尿病發展成為認知障礙整個過程中相關生物標記物的動態變化，希望在糖尿病早期的發展過程中，通過監測血液中相關生物標記物的變化及其相關性來檢測糖尿病大鼠患認知障礙的風險，并確定*佳**時期。

1 儀器和材料

XR-XB102 八臂迷宮( 上海欣軟信息科技有限公司) ，ＲT-6000 酶標儀( 深圳雷杜生命科學股份有限公司) ，LDZ5-2 低速自動平衡離心機( 北京醫用離心機廠) ，UV-2102C 紫外分光光度計( 尤尼柯( 上海) 儀器有限公司) ，FA1004 分析天平( 上海越平科學儀器有限公司) ，微量移液器( 美國 METTLEＲ TOLEDO 公司) ，DGG-9140B 電熱恒溫古風干燥箱( 上海森信實驗儀器有限公司) 。鏈脲佐菌素( 美國 Sigma 公司，批號 S0130) ，葡萄糖測定試劑盒( 長春匯力生物科技有限公司，批號 20120908) ，Aβ42 酶聯**試劑盒( 批號20120826 ) 、胰 島 素 酶 聯 免 疫 試 劑 盒 ( 批 號20120922) ( 上海藍基( BG) 生物科技有限公司) 。Wistar 大鼠，雄性，30 只，體質量 ( 200 ±20) g，清潔級，購自維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號 SCXK( 京) 2012-0001。

2 方法

2. 1 糖尿病大鼠模型的復制

篩選空腹血糖正常的健康雄性 Wistar 大鼠20 只，禁食不禁水 16 h，以 62 mg·kg－ 1的劑量1 次性腹腔注射質量分數 1% 鏈脲佐菌素檸檬酸 － 檸 檬 酸 鈉 緩 沖 液 ( pH 值 為 4. 5，用0. 1 mol·L－ 1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液在冰浴中新鮮配制) ，72 h 后測定靜脈血糖濃度，以隨機血糖濃度≥16. 7 mmol·L－ 1確定為糖尿病模型。

2. 2 分組

將大鼠按成模前體質量、血糖水平隨機分為對照組( n = 10) 和模型組( n = 10) 。常規飼料喂養，自由飲水。

2. 3 動物血漿的制備

采用大鼠眼底靜脈叢取血，建模前采集血液1 次，建模后除*后一次間隔 30 d 外其他每間隔15 d 采集，共采集 5 次，3 000 r·min－ 1離心10 min，吸取上清，－ 80 ℃ 保存，待測。

2. 4 血糖、胰島素和 Aβ42 的測定

血糖采用葡萄糖氧化酶法，用紫外分光光度計測定。胰島素和 Aβ42 采用 BG 公司胰島素和Aβ42 酶聯**試劑盒測定，用標準品繪制標準曲線。

2. 5 八臂迷宮實驗

動物適應實驗環境 2 d 后，稱質量，連續訓練14 d，訓練結束后限制性給予正常飼料。據體質量不同，給予大鼠 16 ～ 20 g 飼料，使體質量保持在正常進食大鼠的 80% ～ 85%。第 15 天測定，記錄以下 4 個指標: 工作記憶錯誤次數( workingmemory errors) ，用來評價短期記憶; 參考記憶錯誤次數( reference memory errors ) ，用來評價長期記憶; 總的入臂次數及測試時間，用來評價大鼠運動量。

2. 6 統計學處理

所有數據均以珋x ± s 表示，用 SPSS 16. 0 統計軟件進行單因素方差分析; 組間采用 t 檢驗，P ＜0. 05 有顯著性差異，P ＜ 0. 01 有非常顯著性差異。糖尿病發展過程中大鼠血漿主要生物標記物的動態變化。

3 結果

3. 1 體質量的動態變化

建模成功后，正常飼料喂養糖尿病大鼠，糖尿病大鼠體質量下降。動態監測大鼠體質量，糖尿病大鼠與對照組比較有非常顯著性差異( P ＜0. 01) 。結果見表 1。

3. 2 一般指標的測定

建模 60 d 后，以每 100 g 大鼠每天代謝量為標準。代謝籠實驗結果顯示，糖尿病大鼠食量、水量、尿量和糞便量明顯高于對照組，差異有顯著性( P ＜0.01) ，表明建模60 d 模型穩定。結果見表2。

3. 3 八臂迷宮實驗

建模70 d，八臂迷宮實驗結果顯示，糖尿病大鼠覓食時間、參考記憶錯誤頻率和平均探究時間明顯高于對照組，并有顯著性差異( P ＜0. 05) ; 工作記憶錯誤頻率高于對照組，但是無統計學意義。結果見表 3。

3. 4 血糖的動態變化

在糖尿病發展過程中，持續檢測血糖水平，模型組血糖明顯高于對照組，并有非常顯著性差異( P ＜0. 01) ，說明糖尿病大鼠模型穩定。糖尿病發展過程中大鼠血漿主要生物標記物的動態變化

3. 5 大鼠血漿中胰島素和胰島素抵抗指數的動態變化

成模 0 ～30 d，血糖、胰島素和胰島素抵抗指數持續性升高，說明糖尿病大鼠處于胰島素抵抗階段; 成模 30 ～45 d，血糖下降，胰島素和胰島素抵抗指數繼續升高，糖尿病大鼠仍然處于胰島素抵抗階段; 成模 45 ～ 75 d，血糖顯著性升高，胰島素生成減少，胰島素抵抗指數明顯下降，并且胰島素生成量低于 0 點。結果見圖 2、3。3. 6 Aβ42 的動態變化成模 15 d，模型組血糖和胰島素水平增高，Aβ42 水平降低; 15 ～ 45 d，胰島素和 Aβ42 水平均升高; 45 ～75 d，胰島素和 Aβ42 水平均降低。結果見圖 4。

a． STZ 選擇性損傷分泌胰島素的胰島 β 細胞，選用 STZ 建立糖尿病大鼠模型穩定，操作簡單，實驗動物無創傷，成模后易護理。

b． 在建模第 60 天，進行代謝籠實驗，測定飲食量、飲水量、尿量和糞便量。統計發現，模型組與對照組比較有顯著性差異，說明模型穩定。建模每隔 15 d 測模型組大鼠血糖，與對照組比較均有顯著性差異。研究表明，持續高血糖可導致認知功能障礙。長期慢性的高血糖可顯著產生“糖毒性”，從而誘導產生淀粉樣蛋白、糖基化產物、活性氧等有害物質，損傷神經元細胞，進而導致認知功能障礙。

c． 建模 70 d 進行八臂迷宮試驗。實驗數據顯示，與對照組比較，模型組大鼠覓食時間、參考記憶錯誤頻率和平均探究時間均有顯著性差異;工作記憶錯誤頻率高于對照組，但是無統計學意義。說明模型組大鼠與對照組大鼠短期記憶無差異，而長期記憶有差異，并且模型組大鼠運動活性降低。證實糖尿病大鼠學習記憶功能出現障礙。同時還觀察到模型組大鼠多出現精神不振、萎靡和反應遲鈍等現象。

d． 糖尿病大鼠成模 0 ～ 15 d，血糖和胰島素含量增多，胰島素抵抗指數增高，Aβ42 水平降低，與對照組比較均有顯著性差異，屬于胰島素抵抗階段。可能是由于 IDE 生成量隨著胰島素的增多代償性增多，此時處于胰島素抵抗初期，并且 IDE可以降解 Aβ42，所以 Aβ42 隨著 IDE 的生成增多而減少。成模15 ～45 d，血糖、胰島素和胰島素抵抗指數水平繼續增高，Aβ42 含量增多。雖然 IDE隨著胰島素的增多代償性增多，但由于 IDE 優先選擇胰島素，且生成量有限，因此血中 Aβ42 隨胰島素的增多而增多，并且變化幅度大于胰島素。成模45 ～75 d，血糖升高，胰島素和胰島素抵抗指數降低，此期間胰島素生成量降低，屬于原發性胰島素生成減少，IDE 隨著胰島素的降低負反饋生成減少，Aβ42 降解減少，含量理應不變或增多，但血中 Aβ42 水平降低，說明此時血中 Aβ42 出現沉積。結合八臂迷宮實驗，糖尿病大鼠在 70 d 出現學習記憶能力下降，精神萎靡，說明在造模 70 d時糖尿病大鼠腦內出現實質性的變化，結合 Aβ42在 45 ～ 75 d 水平下降、出現沉積推測，糖尿病大鼠的學習記憶能力與 Aβ42 出現沉積有關，而對照組沒有顯著性變化，因此糖尿病大鼠患認知障礙的風險明顯高于對照組。

e． 研究結果表明，糖尿病成模 45 d 時，大鼠血漿中胰島素和 Aβ42 水平達到*高峰，之后水平下降，并且在 70 d 時出現認知功能障礙，推測此時 Aβ42 出現沉積。無論胰島素增多還是減少都影響 Aβ42 的水平。因此糖尿病向認知轉變的關鍵時期是糖尿病成模45 ～75 d。單一指標不能有效說明認知問題，臨床沒有八臂迷宮，所以臨床需結合認知評價量表和觀察病人狀態同時監測血中胰島素和 Aβ42 變化判斷糖尿病是否向認知障礙發展—認知出現障礙，精神不振、萎靡、反應遲鈍，并出現胰島素和 Aβ42 水平急劇下降。在糖尿病初期( 大鼠成模 45 ～75 d 時) 給予干預**，是防止糖尿病向認知障礙發展的*好時機，從而抑制糖尿病向認知障礙發展。