【摘要】  目的 研究創傷痛大鼠痛閾的晝夜節律變化。方法 經過痛閾篩選的96只SD大鼠隨機分為12組,每組8只,其中每2組作為1個觀察時間點,分別于8:00(ZT0)、12:00(ZT4)、16:00(ZT8)、20:00(ZT12)、24:00(ZT16)、4:00(ZT20)這6個時間點用甩尾法測定動物痛閾后,分別在相應的時間點對動物進行處理:空白對照組(不截肢)、截肢模型組(截肢)。截肢后立即測定動物的術后痛閾,計算截肢前后的痛閾改變率。結果 正常大鼠痛閾具有明顯的晝夜節律,明期痛閾較高,暗期痛閾較低;創傷痛大鼠痛閾明顯降低,尤其以早晨8點左右痛閾下降明顯。結論 痛閾具有明顯的晝夜節律,研究結果可為臨床選擇手術時機等提供實驗依據。

【關鍵詞】  時間生物學;晝夜節律;痛閾

　　疼痛是多種**的共同病理表現,過強的疼痛或長期慢性的病理性疼痛,將引起機體產生一系列的生理病理改變。大量的臨床和實驗研究表明,在不同的時辰,機體對疼痛的反應性的高低并不是恒定不變的。我們研究了創傷痛大鼠痛閾的晝夜節律變化,現將結果報告如下。

　　1 實驗材料

　　1.1 實驗動物

　　選用SD大鼠(SpragueDawley rat,Inbred strain),清潔級合格動物,體重161.63 g±24.92 g,2月齡,雌雄各半,由成都中醫藥大學實驗動物中心提供(合格證號:川實動管質第9號)。所有動物在實驗前適應性馴養10天,進行痛閾篩選,其標準是:痛闡測定在5～15 s左右能引起甩尾反應者用于實驗,凡痛閾值高于15 s或低于5 s者,表示動物反應遲鈍或過敏,則不納入實驗對象。本實驗所有納入實驗動物的平均痛閾為8.15 s±2.58 s.　　實驗在成都中醫藥大學時間醫學測試室進行,隔音、通風、恒溫(22℃±1℃)、相對濕度60%～65%、自動光暗控制。所有動物均自由飲水攝食。馴養10天后用于實驗。

　　1.2 主要器械及儀器設備

　　7360型疼痛甩尾痛閾測定儀(核定電壓220 V,頻率50 Hz,電流1.25 A,UGO BASILE S.R.L,Biological Research Apparatus,意大利)。

　　2 實驗方法

　　2.1 動物分組及處理

　　2.1.1 動物分組

　　實驗開始前,將經過痛閾篩選符合實驗標準的96只大鼠分別稱重后,將痛閾和體重作為雙重選擇指標,利用SPSS 12.0軟件,將動物隨機分為12組,每組8只,雌雄各半。其中每2組作為1個觀察時間點,分別于6個相應的時間點對不同組的動物進行相應處理。所有動物提供8 am8 pm的人工光照,時間點分別為8am(ZT0,ZT即 zeitgeber time,為授時因子時間),12am(ZT4),4pm(ZT8),8pm(ZT12),12pm(ZT16),4am(ZT20)。

　　每次實驗時注意控制聲、光等因素的干擾。動物適應性馴養10天后,于實驗開始的**天8～12點內測定所有動物的痛閾作為基礎痛閾;**天在以上6個時間點分別對每16只大鼠進行痛閾測定,測得值作為相應時間點的術前痛閾;第三天進行動物處理,每個時間點的4個組的動物的手術及痛閾測定(術后痛閾)均同時開始進行。

　　2.1.2 動物處理

　　每個時間點的2組動物分別作以下處理。每個時間點的動物在同一時間點同時開始進行處理。空白對照組(簡稱空白組):不造模,于實驗開始后與其他各組用同樣的方法、同樣的時間捆綁固定。動物總的固定時間為30 min.固定結束后立即測定痛閾。截肢模型組(簡稱截肢組):將大鼠固定于自制固定器上,固定10 min后行截肢手術,手術結束后繼續固定動物,至總固定時間滿30 min.固定結束后立即測定痛閾,測定痛閾完畢將動物放回籠內精心飼養。

　　2.1.3 造模方法

　　參照文獻的方法進行:**右后肢皮膚,在踝關節下約0.5 mm處截斷右后肢,縫合皮膚。

　　2.2 痛閾測定方法

　　篩選動物時,基礎痛閾測定在上午812點進行。納入實驗的動物,分別在相應的時間點1 h內進行痛閾測定。測定時均在同一室溫條件下,分別在6個時間(08:00、12:00、16:00、20:00、24:00、04:00)對處理前后的動物的痛閾進行測定。測定痛閾時由固定人員測量動物甩尾反應潛伏期,所有動物均以流水編號進行痛閾測試。

　　本實驗采用輻射熱甩尾法測定痛閾,每個時間點測試時,所有動物按照流水號測定一次后,再按照流水號重復測定**次、第三次,保證每只動物每次測試間隔均在10 min以上。取3次測定的平均值作為*后的痛閾。

　　處理前后2次測定共得到兩個痛閾值,分別稱為術前痛閾和術后痛閾。以痛閾變化率作為衡量針刺抗創傷痛的效應的指標之一。痛閾變化率=(術后痛閾術前痛閾)/術后痛閾×100%.創傷痛大鼠痛閾的晝夜節律實驗研究

　　2.3 統計學處理

　　統計分析采用SPSS 12.0軟件進行,另外,所有數據還采用Halberg余弦法進行生物節律分析。

　　3 結果

　　3.1 截肢手術前后大鼠痛閾的總體變化情況

　　將95只納入實驗的大鼠(馴養過程中1只大鼠死亡),分別于實驗前、后分6個時間點測定其在相應時間點的痛閾,計算其痛閾變化率。截肢、電針后,在相應時間立即測定大鼠痛閾,結果見表1及圖1。表1 截肢手術前后不同時間點動物痛閾變化比較表2 空白對照組截肢手術前后24小時動物痛閾節律變化比較表3 截肢模型組截肢手術前后24小時動物痛閾節律變化比較　　　圖1 處理前24小時周期所有大鼠不同時間點全部大鼠痛閾變化的折線圖

　　3.2 空白對照組大鼠實驗處理前后痛閾的晝夜節律變化情況

　　對截肢手術前后空白對照組大鼠各時間點的痛閾利用Halberg余弦軟件單個余弦法程序進行余弦函數擬合,并分別計算其P值(P<0.05表示具有明顯的節律性)、中值、振幅及峰相位,結果顯示大鼠痛閾具有明顯的晝夜節律,如表2所示。由于空白對照組的痛閾變化率沒有明顯變化,所以不對其作節律分析。截肢手術前24小時周期全部大鼠痛閾的極坐標圖和余弦曲線見圖2、圖3.創傷痛大鼠痛閾的晝夜節律實驗研究

　　從以上圖表可以看出,空白對照組大鼠痛閾在實驗前后的24小時周期中具有明顯的晝夜節律,且與實驗前的總體變化節律接近,均為白天痛閾高,夜間痛閾低,其中16點時*高,0點(24點)4點*低。圖2 截肢手術前24小時周期全部大鼠痛閾的極坐標圖和余弦曲線圖　圖3 空白對照組實驗后24小時動物痛閾的極坐標圖和余弦曲線圖

　　3.3 截肢模型組大鼠截肢手術前后痛閾的晝夜節律變化情況

　　對截肢手術前后截肢模型組大鼠各時間點的痛閾利用Halberg余弦軟件單個余弦法程序進行余弦函數擬合,結果見表3及圖4～圖6.創傷痛大鼠手術前痛閾節律與空白對照組類似。截肢模型組大鼠痛閾在實驗前的24小時周期中具有明顯的晝夜節律,與實驗前的總體變化節律接近,均為16點時*高,0點(24點)～4點*低;實驗后的痛閾和痛閾變化率均顯示出一定的晝夜節律,提示創傷痛大鼠的痛閾仍然具有晝夜節律,其痛閾變化率也表現出較弱的晝夜節律(P值為0.049,與0.05接近),說明各時間點痛閾變化并不相同,出現明顯的時辰差異。圖4 截肢模型組截肢手術前24小時動物痛閾的極坐標圖和余弦曲線圖圖5 截肢模型組截肢手術后24小時動物痛閾的極坐標圖和余弦曲線圖圖6 截肢模型組截肢手術后24小時動物痛閾變化率的極坐標圖和余弦曲線圖

　　4 討論

　　早在19世紀,人類就已發現疼痛反應具有晝夜節律性。大量的臨床和實驗研究表明,在不同的時辰,機體對疼痛的反應性的高低并不是恒定不變的。機體的痛閾具有明顯的以24 h為周期的晝夜節律,如Li G等對小鼠的痛閾研究顯示,夜間小鼠甩尾潛伏期更長(痛閾更高),且**受體拮抗劑納洛酮(10 mg/kg,i.p.)可降低痛閾[2];Koch HJ等研究了13例2127歲健康受試者在 6點、12點、18點和24點4個時間點對止血帶壓迫所致疼痛的耐受性,研究顯示,24點時對壓迫性疼痛的耐受性*高[3]。而且隨著疼痛、鎮痛的基礎和臨床研究的逐漸深入,其對**功能的影響也越來越受到人們的關注。手術、創傷等對機體造成**功能的抑制已研究很多,這種疼痛及創傷等應激所造成的機體**抑制等效應,也具有明顯的晝夜節律特征[4]。時間生物學研究表明,人及動物對疼痛的敏感性均存在時間節律性,而許多鎮痛**及鎮痛手段的鎮痛效應也具有時間節律性,如**類鎮痛劑夜間的鎮痛效應明顯優于白天[5]。我們的研究結果顯示,正常大鼠痛閾具有明顯的晝夜節律,其峰值在白天12點16點,谷值在夜間0點凌晨4點左右,即明期痛閾較高,暗期痛閾較低;創傷痛大鼠痛閾明顯降低,尤其以早晨8點左右痛閾下降明顯,這可為臨床選擇手術時機等提供實驗依據。