【摘要】 目的 探討銀杏內(nèi)脂B(Ginkgolide B,GB)對大鼠缺氧模型焦慮樣行為的改善作用。方法 36只SPF級SD大鼠隨機分為平原對照組、高原缺氧組、GB干預組,每組12只。依托高原人工實驗艙平臺,以平原常氧條件飼養(yǎng)大鼠為平原對照組,以高原人工實驗艙內(nèi)模擬6000m高原缺氧環(huán)境,高原缺氧組和GB干預組在艙內(nèi)6d,制造高原缺氧模型,其中GB干預組在進艙前4d以GB灌胃給藥,每天給藥劑量為120mg/kg。采用曠場實驗(open field test,OFT)和高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實驗來觀察GB對缺氧導致的大鼠焦慮行為的影響。結(jié)果 在OFT中,平原對照組大鼠進入中央?yún)^(qū)域時間、次數(shù)以及運動總路程顯著高于高原缺氧組,在EPM 試驗中進入開臂時間和次數(shù)百分比也顯著高于高原缺氧組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在OFT和EPM 試驗中,GB干預組的各項檢測指標較高原缺氧組有顯著的升高,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 預先給予GB可以有效緩解高原缺氧導致的大鼠焦慮樣行為。
由于高原特有的缺氧、低氣壓、強紫外線等一系列環(huán)境條件,急進高原過程中士兵常常會伴隨有生理和心理的應激反應。其中心理應激會使人產(chǎn)生焦慮、抑郁甚至精神分裂等情緒變化,嚴重影響**的戰(zhàn)斗力。因此研究能夠有效預防或治急性缺氧條件所致焦慮樣情緒的藥十分重要。
銀杏內(nèi)酯B(Ginkgolide B,GB)是銀杏葉提取物中的主要成分之一,成份主要為萜類內(nèi)酯,已有研究表明,在急性缺氧條件下,GB有抑制神經(jīng)細胞凋亡和氧化應激的作用,從而保護神經(jīng)細胞,緩解大鼠的認知功能障礙,本研究作者推測GB的這種保護神經(jīng)細胞的作用可能也會改善缺氧所致焦慮行為的產(chǎn)生。但另一報道顯示雖然銀杏葉提取復合物(成分包括銀杏內(nèi)酯A、B、C和白果內(nèi)酯)在動物實驗中表現(xiàn)出抑制小鼠焦慮樣行為的作用,但這種抗焦慮作用主要是由銀杏內(nèi)酯A 提供,而不是GB[7]。為了探討GB是否有抗焦慮的作用,本研究使用曠場實驗(open field test,OFT)和高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)實驗評價急性缺氧條件下的大鼠焦慮樣行為,以期為缺氧所致焦慮的預防和治提供新的藥選擇。
1 材料和方法
1.1 實驗動物
SPF級成年雄性SD 大鼠36只,體質(zhì)量(200±20)g,購自新疆醫(yī)科大學動物實驗中心,實驗動物質(zhì)量合格證號:20111125008。
1.2 試劑與儀器
高原人工實驗艙(新疆**總醫(yī)院自主建造);EPM 實驗儀器(型號:XR-XG201,上海欣軟信息科技有限公司);OFT實驗儀器(型號:XR-XZ301,上海欣軟信息科技有限公司);SuperMaze動物行為學視頻分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司);GB(貨號:C31J6G2014,純度>98%,上海源葉生物科技有限公司)。
1.3 實驗SD大鼠飼養(yǎng)方法及分組將SD大鼠在新環(huán)境下先飼養(yǎng)適應3d。所有大鼠均飼養(yǎng)在動物房中,保持室內(nèi)溫度(25±1)℃,每天12h晝夜交替,給予同種飼料喂養(yǎng),可自由進食、飲水,采用玉米粒做墊料,每兩天更換一次。
實驗時將大鼠分為3組,分別為平原對照組、高原缺氧組、GB干預組,各12只。其中GB干預組大鼠在進入高原人工實驗艙之前每天固定時間給與120mg/kg劑量的GB灌胃,連續(xù)給藥4d后與高原缺氧組大鼠一起進入高原人工實驗艙。平原對照組大鼠一直在動物房中常規(guī)條件飼養(yǎng)。
1.4 模擬急進高原條件
將GB干預組和高原缺氧組大鼠同時置于特殊環(huán)境人工實驗艙內(nèi),以25m/s的速度快速升至6000m海拔,自然24h晝夜交替,并不間斷的以5.5L/min的速度注入新鮮空氣以提供飼養(yǎng)動物所需的氧氣,同時排出二氧化碳,艙內(nèi)溫度維持在(24±2)℃,濕度40%~50%,大鼠自由攝進食物和水。實驗期間觀察大鼠在高原暴露期間的飲食、活動、情緒等狀態(tài),在艙內(nèi)連續(xù)暴露6d后出艙,進行動物行為學實驗的評價。
1.5 動物行為學實驗
實驗開始之前,徹底清潔實驗裝置,采用窗簾將OFT和EPM 與外界環(huán)境分隔開,室內(nèi)暗光(以1.5m距離處能區(qū)分大鼠細微活動的較低亮度為準)并保持恒亮,室溫20℃左右,測試過程中保持周圍環(huán)境安靜。設置好相關程序參數(shù),其中攝影記錄為延遲5s記錄,共記錄300s。大鼠出艙后將其放置在實驗室半小時以適應環(huán)境。實驗開始時,將大鼠背對實驗者從籠中取出(每次一只大鼠),放入曠場以及十字迷宮裝置的中心,實驗者立刻離開,使用SuperMaze動物行為軌跡跟蹤系統(tǒng)采集大鼠在300s內(nèi)的活動信息。每只大鼠在完成測試后,使用75%酒精將設備擦洗干凈后,再進行下一只大鼠的測試。
1.6 實驗中需要記錄的評價指標
OFT實驗動物出現(xiàn)焦慮心理時,其對開闊環(huán)境和新異環(huán)境中的恐懼和探究的矛盾心理特性會反應在行為學上,表現(xiàn)為焦慮越嚴重,就越傾向于在周邊區(qū)域活動,以獲得一種安quan感。因此,實驗動物進入中央?yún)^(qū)域的次數(shù)越多,在中央?yún)^(qū)域活動的時間越長則說明動物的焦慮情緒越低。觀察實驗動物的運動總路程(cm)、進入中心區(qū)域時間(s)、進入中心區(qū)域次數(shù)(n)。
EPM 實驗主要是利用動物對新異環(huán)境的探究和對高懸開臂的恐懼形成矛盾心理來反應動物的焦慮狀態(tài)。大鼠進入開臂時間和次數(shù)越多,說明大鼠焦慮程度越低,反之則說明其焦慮程度越高。觀察實驗動物的運動總路程(cm)、開臂時間百分比(%)、開臂次數(shù)百分比(%)。
1.7 統(tǒng)計學處理
采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料以均數(shù)±標準差(珚x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。
2 結(jié)果
2.1 OFT結(jié)果
由動物行為軌跡跟蹤系統(tǒng)采集的大鼠運動軌跡可以看到高原缺氧組大鼠相較于平原對照組大鼠在中央?yún)^(qū)域的運動軌跡明顯減少,而GB干預組大鼠在中央?yún)^(qū)域的活動時間則和平原對照組相近,見圖1。統(tǒng)計學分析后可以看出在到運動總路程、進入中心區(qū)域時間和次數(shù)上,高原缺氧組顯著低于平原對照組和GB干預組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=10.991,P<0.01),而平原對照組和GB干預組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),GB干預組與高原缺氧組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。以上結(jié)果說明高原缺氧環(huán)境會導致大鼠產(chǎn)生焦慮樣行為,而GB的預給藥可以改善大鼠的焦慮狀態(tài)。
2.2 EPM 實驗結(jié)果
由動物行為軌跡跟蹤系統(tǒng)采集的大鼠運動軌跡可以看出高原缺氧組大鼠相較于平原對照組大鼠在開臂
區(qū)的運動軌跡明顯減少,而GB干預組大鼠在開臂區(qū)的活動時間則和平原對照組相近,見圖2。運動總路程、開臂區(qū)活動時間百分比和進入次數(shù)百分比上,高原缺氧組顯著低于平原對照組和GB干預組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(F=11.016,P<0.05),但平原對照組與GB 干預組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),GB干預組與高原缺氧組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。
3 討論
焦慮是動物個體在面對潛在威脅和壓力時產(chǎn)生的一種正常情緒反應,人體在急進高原后,由于低壓、缺氧、強紫外線等環(huán)境的變化會造成一系列應激反應,從而產(chǎn)生焦慮、抑郁的心理應激改變,會對正常的生活和工作造成負面影響。有研究表明高原駐防官兵中存在大量焦慮、抑郁等心理癥狀的個體,并且這種焦慮和抑郁狀態(tài)可增加慢性高原病的的發(fā)病風險,嚴重影響官兵的身心健康。近年來,傳統(tǒng)中藥在抗焦慮方面的作用得到越來越多的關注,有研究報道,紅景天可通過增高海馬神經(jīng)細胞中的5-羥色胺含量,從而降低缺氧刺激下大鼠的焦慮樣行為。另一中成藥芪參復康膠囊也被證明有明顯的抗焦慮抗抑郁的作用,效果甚至優(yōu)于紅景天。而本文則選用了另一種傳統(tǒng)中藥GB,并對其潛在的抗焦慮作用進行了初步研究。
本研究采用OFT和EPM 兩個經(jīng)典實驗來評價動物焦慮樣行為。OFT的運動總路程反應大鼠的興奮性,本實驗可見GB干預組的運動總路程顯著高于高原缺氧組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),表明GB能改善缺氧造成的大鼠興奮性下降。而EPM 實驗中,高原缺氧組大鼠進入開臂的時間和次數(shù)顯著低于平原對照組和GB干預組,組間比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),說明GB緩解了大鼠的焦慮情緒。本研究通過以上行為學實驗,初步探討了GB對缺氧導致的大鼠焦慮樣行為的改善作用,但本研究實驗設計仍存在一定問題,首先作者參考之前研究結(jié)果只選用了120mg/kg這一個*大用藥劑量,而沒有進行**梯度的設定,不能說明GB的抗焦慮效果是否有**劑量依賴性。其次,臨床上對于病理性焦慮的治常采用苯二氮卓類藥,如地泮,該類藥是通過作用于抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸A 受體的ZA位點發(fā)揮其抗焦慮效應。因此在動物焦慮模型的相關研究中常使用***做為陽性對照藥,而本實驗中沒有設立陽性對照組,降低了本實驗結(jié)果的可靠性。以上問題都是接下來研究中需要改進的。
缺氧導致的焦慮是一個復雜的病理生理變化,牽涉到神經(jīng)生化、神經(jīng)***等多方面的變化,其中神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺在焦慮動物模型中有顯著的表達變化,其參與焦慮的產(chǎn)生由不同的受體介導。有研究表明GB可以阻斷5-HT(3)A 受體,提示這可能是GB發(fā)揮抗焦慮作用的機制之一。在中神經(jīng)系統(tǒng)中,參與情緒調(diào)節(jié)的腦區(qū),包括杏仁核、前額皮質(zhì)、丘腦、海馬和扣帶回等腦部結(jié)構。其中,海馬是參與情緒調(diào)節(jié)非常重要的腦區(qū),在情緒變化、應激等信息整合過程中起主要作用,同時也是大量研究者觀察神經(jīng)可塑性變化的腦區(qū)。本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),在低壓低氧條件下,GB可以改善大鼠的認知功能障礙,提示其潛在的保護海馬神經(jīng)元作用,這可能也是GB具有抗焦慮作用的原因之一。綜上所述,本研究初步探討了GB對缺氧導致的大鼠焦慮樣行為的改善作用,為進一步探討GB抗焦慮機制提供了穩(wěn)定的動物模型和藥劑量參考。