材料和方法
1 材料
1. 1 藥品與試劑葛根素( 新鄉(xiāng)恒久遠(yuǎn)藥業(yè)有限公司,批號(hào)20121201) ,氟西汀( fluovetine,F(xiàn)LU,蘇州禮來制藥,批號(hào)2076AC) ,小鼠5-HT 試劑盒( 批號(hào)20140503) 、小鼠NE 試劑盒( 批號(hào)20140607) 、小鼠DA 試劑盒( 批號(hào)20140708) 均為北京誠林生物技術(shù)有限公司分裝,CREB-1( 批號(hào)999802W) 、p-CREB-1( 批號(hào)140601) 、BDNF ( 批號(hào)140526 ) 、TrkB ( 批號(hào)曠場9H124) 、β-actin( 批號(hào)140120) 多克隆抗體均購于北京博奧森生物技術(shù)公司,其它試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?
1. 2 主要儀器曠場反應(yīng)箱( 上海欣軟信息科技有限公司) ,強(qiáng)迫游泳水缸( 上海欣軟信息科技有限公司) ,ECLIPSE 50i 型顯微鏡及攝像系統(tǒng)( 日本Nikon) ,DT1001 電子天平( 常熟市意歐儀器儀表有限公司) ,HTT700T 透射電子顯微鏡( 日本日立公司) ,5026 型酶聯(lián)**檢測儀( 奧地利TECAN 公司) ,MR1812 型臺(tái)式高速低溫離心機(jī)( 法國JOUAN公司) ,PUEELAB PLUS 超純水系統(tǒng)( 美國波爾公司) ,DYY-Ⅲ27B 垂直電泳槽及穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀( 北京六一儀器廠) ,TS-100 脫色搖床( 南京庚辰儀器有限公司) ,UV-2550 型紫外分光廣度儀( 日本島津) ,MDF-492 超低溫冰箱( 日本三洋) ,METTLER TOLEDOPH 測試儀( 上海秋騰貿(mào)易公司) ,Cetrfuge5417R小型高速臺(tái)式離心機(jī)( 上海富眾生物科技公司) 等。
1. 3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級(jí)雌性昆明小鼠,體質(zhì)量( 20g ± 2 g) ,購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)****評(píng)價(jià)中心,生產(chǎn)許可證號(hào)[SCXK( 黑) 2013-0004]。
2 方法
2. 1 動(dòng)物分組、模型制備及給藥OFT 篩選評(píng)分相近、體重均勻小鼠50 只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。飼養(yǎng)條件為,5只/籠,室溫( 22 ± 1) ℃,濕度( 50 ± 10) %,自然光照( 12L /12D) ,自由攝食飲水。根據(jù)SPSS 19. 0統(tǒng)計(jì)軟件產(chǎn)生隨機(jī)數(shù)字分為5 組,即假手術(shù)組( Sham) 、圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組( OVX + CUMS) 、氟西汀組( 3 mg /kg) 、雌**組( 0. 15 mg /kg) 、葛根素組( 92 mg /kg) ,每組10 只。采用小鼠雙側(cè)卵巢切除( OVX) 聯(lián)合慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激( CUMS) 法制備圍絕經(jīng)期抑郁癥動(dòng)物模型,其中假手術(shù)組小鼠僅剪去卵巢旁體積相同脂肪組織。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)7 d后,除Sham 組外,其余各組給予CUMS,方法為禁食( 24 h) 、禁水( 24 h) 、晝夜顛倒( 12 D/12 L) 、冰水游泳( 5 min) 、45℃環(huán)境熱烘( 5 min) 、夾尾( 1 min) 、潮濕墊料、電擊足底等7 種刺激,這7 種刺激每天隨機(jī)采取一種,每天刺激都不規(guī)律。各給藥于每日應(yīng)激前1 h 灌胃給藥,其余各組給予等體積的生理鹽水灌胃,每日每次0. 2 ml,共計(jì)21 d。
2. 2 指標(biāo)測定2. 2. 1 上皮角化實(shí)驗(yàn)7 d 內(nèi)連續(xù)監(jiān)測各實(shí)驗(yàn)組小鼠上皮脫落細(xì)胞相,觀察動(dòng)情周期變化,以證明去勢(shì)是否成功。
2. 2. 2 曠場實(shí)驗(yàn)( open filed test,OFT) 制備小鼠曠場反應(yīng)箱( 40 cm × 40 cm × 38 cm) ,內(nèi)壁涂黑,底面平均劃分25 個(gè)小格。選取安靜場地,將小鼠放入反應(yīng)箱中央,攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物在曠場內(nèi)6 min 的行為學(xué)表現(xiàn),計(jì)算水平運(yùn)動(dòng)( 3 或4 只腳同在一個(gè)格內(nèi)計(jì)1 分,穿越1 格計(jì)1 分,沿線行走每8 cm 計(jì)1分) 及垂直運(yùn)動(dòng)得分( 記錄小鼠站立次數(shù); 雙前足離
地1 次為1 分) 。兩只動(dòng)物之間用75% 酒精擦拭底部及四壁,以免“前任者效應(yīng)”。實(shí)驗(yàn)在應(yīng)激第1 d、21 d( 9∶ 00 ~ 11∶ 00) 各測定1 次。
2. 2. 3 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)( force swimming test,F(xiàn)ST)
將小鼠單獨(dú)置于水深15 cm 的玻璃缸內(nèi)( 高20 cm,直徑14 cm) ,水溫( 25 ± 1) ℃,游泳6 min,觀察記錄后4 min 內(nèi)小鼠在水中累計(jì)不動(dòng)時(shí)間。每只小鼠實(shí)驗(yàn)結(jié)束后沖洗水缸、換水,避免對(duì)下一只測試小鼠產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)在應(yīng)激第1 d、21d( 9∶ 00 ~ 11∶ 00) 各測
定1 次。
2. 2. 4 體質(zhì)量測試( body weight measurement,BWM) 在實(shí)驗(yàn)第1 d、21 d 分別進(jìn)行小鼠體質(zhì)量測定。
2. 2. 5 尼氏染色行為學(xué)測試結(jié)束后第2 d,心臟灌流固定取腦,石蠟切片脫蠟至水,經(jīng)尼氏染色、脫水、透明及封固后,光鏡觀察海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化并拍照。
2. 2. 6 透射電鏡行為學(xué)測試結(jié)束后第2 d,斷頭取腦,切取小鼠海馬組織( 1 mm × 1 mm × 5 mm) ,2.5%戊二醛和1% 鋨酸4℃固定2 h,雙蒸水沖洗,酒精梯度脫水,環(huán)氧樹脂包埋,醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色,透射電鏡觀察并拍照。
2. 2. 7 腦組織單胺類遞質(zhì)5-HT、NE 及DA 含量測定行為學(xué)測試結(jié)束后第2 d,斷頭取腦,冰臺(tái)上迅速取小鼠腦組織并稱取重量。勻漿,4℃、3000 rpm/min - 1離心20 min,靜止,吸取上清,- 80℃保存。按照ELISA 試劑盒說明書操作方法,測定腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE 及DA 含量。
2. 2. 8 海馬組織CREB-BDNF 信號(hào)通路主要蛋白含量測定行為學(xué)測試結(jié)束后第2 d,斷頭取腦、剝離海馬,投入液氮凍結(jié)。冰上研磨,經(jīng)蛋白質(zhì)抽提、定量、電泳、轉(zhuǎn)膜及顯色后,AlphaimagerTM 凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描,測定光密度。采用目的條帶與內(nèi)參蛋白條帶密度比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理: 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為計(jì)量資料,應(yīng)用SPSS 19. 0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理,并以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差( 珋x ± s) 表示。多組數(shù)據(jù)差異性檢驗(yàn)采用One-Way ANOVA,組間均數(shù)兩兩比較應(yīng)用LSD 檢驗(yàn),以P < 0. 05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果
1 小鼠動(dòng)情周期變化
動(dòng)物脫落細(xì)胞相隨性周期呈現(xiàn)規(guī)律變化,我們進(jìn)行上皮角化實(shí)驗(yàn)可鑒定小鼠性周期變化,并判定動(dòng)物去勢(shì)是否成功。結(jié)果顯示,與Sham組比較,各OVX 組小鼠脫落細(xì)胞呈現(xiàn)大量白細(xì)胞和少量上皮細(xì)胞,7d 內(nèi)連續(xù)監(jiān)測無周期性細(xì)胞變化,證明小鼠去勢(shì)成功,并可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)( Fig. 1) 。
2 葛根素對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠行為學(xué)影響
2. 1 OFT 結(jié)果造模第1 d,各組小鼠OFT 水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P ﹥0. 05) 。在應(yīng)激第21 d,與sham 組比較,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠OFT 水平運(yùn)動(dòng)得分、垂直運(yùn)動(dòng)得分減少( P < 0. 01或P < 0. 05) ; 與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較,給予
FLU、E 和Pue **后可增加OFT 水平運(yùn)動(dòng)及垂直運(yùn)動(dòng)得分( P <0. 01 或P <0. 05) ,差異顯著( 表1) 。
2. 2 FST 結(jié)果造模第1 d,各實(shí)驗(yàn)組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間比較無顯著性差異( P > 0. 05) 。在應(yīng)激第21 d,與Sham 組比較,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間增加( P < 0. 01) ; 與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較,F(xiàn)LU 組、E 組、Pue 組小鼠游泳不動(dòng)時(shí)間減少( P < 0. 01) ,差異顯著( 表2) 。
2. 3 BWM 結(jié)果造模第1 d,各實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量比較差異無顯著性差異( P > 0. 05) 。在應(yīng)激第21d,與sham 組比較,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠體質(zhì)量減少( P < 0. 01) ; 與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較,給予FLU、E 及Pue **后,各組小鼠體質(zhì)量增加( P < 0. 01 或P < 0. 05) ,差異顯著( 表2) 。
3 葛根素對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠海馬組織形態(tài)學(xué)影響
3. 1 海馬組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察與Sham 組比較,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元分層不清,排列不規(guī)則,部分神經(jīng)元丟失、數(shù)量減少及萎縮,尼氏體數(shù)量減少。與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較,給予FLU、E 及Pue **后,可改善海馬CA3 區(qū)神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為神經(jīng)元分層明顯,排列較規(guī)則、胞膜較完整,胞核形態(tài)正常,尼氏體數(shù)量增加( Fig. 2)
3. 2 海馬組織超微結(jié)構(gòu)與Sham 組比較,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元微絨毛及細(xì)胞鏈接消失,胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器少,線粒體嵴絮狀變性,突觸結(jié)構(gòu)減少,核內(nèi)異染色質(zhì)聚集、呈現(xiàn)凋亡早期變化;與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較,給予FLU、E 及Pue**后,可改善海馬區(qū)神經(jīng)元損傷,表現(xiàn)為神經(jīng)元形態(tài)較規(guī)則、胞膜表面有微絨毛及細(xì)胞鏈接,核膜清楚完整,線粒體嵴清晰、突觸結(jié)構(gòu)完整,數(shù)量適中Fig. 3) 。
4 葛根素對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠腦組織單胺類遞質(zhì)含量影響與Sham 組比較,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠腦組織5-HT、NE 及DA 含量減少( P < 0. 01) ; 與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較,給予FLU、E 及Pue **后,小鼠腦組織5-HT、NE 及DA 含量增加( P < 0. 01
或P < 0. 05) ,差異顯著( 表3) 。
5 葛根素對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF 及TrkB 蛋白表達(dá)影響與sham 組比較,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF 及TrkB 蛋白表達(dá)下降( P < 0. 01) ; 與圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組比較,F(xiàn)LU 組、E 組及Pue 組小鼠海馬組織CREB-1、p-CREB-1、BDNF 及TrkB 蛋白表達(dá)增加( P < 0. 01 或P < 0. 05,表
4,F(xiàn)ig. 4) 。
討論
海馬為腦邊緣系統(tǒng)之一,發(fā)出神經(jīng)纖維投射到額葉皮質(zhì)、杏仁核等與情感有關(guān)的關(guān)鍵腦區(qū),參與學(xué)習(xí)、記憶及情緒調(diào)節(jié),對(duì)負(fù)性情緒高度敏感且易損傷,在生理及病理?xiàng)l件下具有神經(jīng)可塑性。研究證實(shí),長期慢性應(yīng)激可誘導(dǎo)生物體海馬神經(jīng)元損傷,雌**低下可影響腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的合成、神經(jīng)元生長、突觸形成等。因此,慢性應(yīng)激與雌**低下相互作用、相互影響共同成為圍絕經(jīng)期抑郁癥致病內(nèi)、外兩個(gè)主要因素。
在本研究中,我們以FLU、雌**作為陽性對(duì)照**,從五個(gè)方面評(píng)價(jià)葛根素對(duì)圍絕經(jīng)期抑郁模型小鼠的**作用。一是在模型制備中,我們采用OVX聯(lián)合CUMS 法制備圍絕經(jīng)期抑郁癥動(dòng)物模型,該方法較大程度模擬了圍絕經(jīng)期抑郁癥的核心癥狀及相似病因、可操作性強(qiáng),預(yù)實(shí)驗(yàn)表明采用OVX + CUMS方法在造模效果上不相互干擾。二是動(dòng)物行為學(xué)測試,是評(píng)價(jià)模型是否制備成功及**是否有效的標(biāo)準(zhǔn),在動(dòng)物行為學(xué)測試中,我們采用OFT 測試動(dòng)物水平及垂直運(yùn)動(dòng)得分,評(píng)價(jià)動(dòng)物“自發(fā)活動(dòng)及探索行為”,采用FST 及BWM 模擬臨床抑郁癥患者“行為
絕望”及“食欲減退、體重減低”的體征。三是通過觀察動(dòng)物海馬組織病理形態(tài)學(xué)變化,揭示引發(fā)動(dòng)物抑郁樣行為的物質(zhì)基礎(chǔ)。四是依據(jù)抑郁癥“單胺類神經(jīng)遞質(zhì)缺乏”學(xué)說,評(píng)價(jià)環(huán)境應(yīng)激、雌**缺乏與下丘腦-垂體-腎上腺素軸( hypothalamic pituiary adrenalaxis,HPA) 軸之間的聯(lián)系。五是依據(jù)抑郁癥**新策略-靶向神經(jīng)可塑性。“CREB-BDNF 信號(hào)通路功能紊亂”是抑郁癥發(fā)**展的樞紐環(huán)節(jié)[9],該通路在情緒調(diào)節(jié)中起重要作用,并與抑郁癥“海馬神經(jīng)可塑性失調(diào)”密切相關(guān),為神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。該通路相關(guān)蛋白及因子的表達(dá)在抑郁癥發(fā)病及抗抑郁**起效過程中起重要作用[11],并對(duì)海馬神經(jīng)元增殖、分化、存活及可塑性調(diào)節(jié)都具有影響。
結(jié)果顯示,圍絕經(jīng)期抑郁癥模型組小鼠表現(xiàn)抑郁樣行為與海馬神經(jīng)元損傷、神經(jīng)元早期凋亡,腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)缺乏,CREB-BDNF 信號(hào)通路主要蛋白CREB-1、p-CREB-1、BDNF 及TrkB 表達(dá)減少密切相關(guān)。葛根素因化學(xué)結(jié)構(gòu)與動(dòng)物雌**相似性而具有抗圍絕經(jīng)期抑郁癥活性及神經(jīng)保護(hù)作用,其機(jī)制可能涉及抑制小鼠海馬神經(jīng)元損傷、凋亡,上調(diào)腦組織單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE、DA 含量,上調(diào)CREB-BDNF 信號(hào)通路主要蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。
綜上所述,雌**缺乏引發(fā)海馬神經(jīng)元損傷及早期凋亡為圍絕經(jīng)期抑郁癥模型動(dòng)物神經(jīng)生化改變的物質(zhì)基礎(chǔ),葛根素通過影響CREB-BDNF 信號(hào)通路功能而調(diào)控圍絕經(jīng)期抑郁癥模型小鼠海馬神經(jīng)可塑性變化。但具體有關(guān)應(yīng)激、雌**、神經(jīng)遞質(zhì)與CREB-BDNF 信號(hào)通路的關(guān)聯(lián)尚需進(jìn)一步探討。