【摘要】 目的 評價烏司他丁預(yù)先給藥對異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙的影響。方法 健康雄性SPF 級 C57BL /6 小鼠 36 只，18 月齡，體重 27 ～ 35 g，采用隨機數(shù)字表法，將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對照組 ( C組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預(yù)先給藥組( S 組) 。I 組和 S 組暴露于 1% 異氟醚 3 h，連續(xù) 7 d; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。末次暴露結(jié)束后 24 h 進行認知功能測試，包括 Morris 水迷宮和曠場實驗測試，測試完畢后立即處死小鼠取海馬，采用 ELISA 法測定白細胞介素 － 6( IL － 6) 、白細胞介素 － 1β( IL － 1β)和腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 含量。結(jié)果 與 C 組比較，I 組逃避潛伏期延長，原平臺停留時間和穿越平臺次數(shù)減少，曠場中心區(qū)停留時間縮短，海馬 IL － 1β、TNF－ α 含量升高( P ＜ 0. 05) ，S 組上述指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義( P ＞ 0. 05) 。與 I 組比較，S 組逃避潛伏期明顯縮短，原平臺停留時間和穿越原平臺次數(shù)增多，曠場中心區(qū)停留時間延長，海馬 IL － 1β、TNF － α 含量降低( P ＜ 0. 05) 。結(jié)論 烏司他丁預(yù)先給藥可改善異氟醚暴露所致老年小鼠認知功能障礙，其機制可能與抑制海馬炎癥因子過度釋放有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 異氟醚; 烏司他丁; 老年鼠; 認知障礙; 海馬; 炎癥

術(shù)后認知障礙( POCD) 是老年患者術(shù)后常見的并發(fā)癥之一。研究表明，異氟醚可導(dǎo)致 POCD。因此探尋有效措施預(yù)防和**異氟醚導(dǎo)致的認知功能障礙具有重要意義。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑，可減少炎癥介質(zhì)的過度釋放。研究表明，烏司他丁具有神經(jīng)保護作用，但其能否有效地防治異氟醚所致認知功能障礙尚不明確。本研究擬評價烏司他丁預(yù)先給藥對異氟醚暴露致認知功能障礙的影響。

1 材料與方法

1． 1 實驗動物 健康雄性 SPF 級 C57BL /6 小鼠 36只，18 月齡，雄性，體重 27 ～ 35 g，由中山大學(xué)實驗動物中心提供，于室內(nèi)溫度 22℃ ，濕度 50% ，12 h/12 h 晝夜明暗交替的環(huán)境中飼養(yǎng)。采用隨機數(shù)字表法，將其分為 3 組( n = 12) ; 空白對照組( C 組) 、異氟醚組( I 組) 、烏司他丁預(yù)先給藥組( S 組) 。

1． 2 方法 參照文獻［4］的方法并加以改進，將小鼠置于密閉麻醉箱中，頂蓋一小孔與氣體監(jiān)測儀的導(dǎo)管相通，持續(xù)監(jiān)測箱內(nèi)異氟醚、CO2和 O2的濃度。麻醉箱底部浸于 37℃ 的恒溫水浴箱中。I 組和 S 組暴露于1% 異氟醚( 批號: 936245U，Abbott 公司，美國) 3 h，異氟醚以空氣( 21% 氧氣混合 79% 氮氣) 輸送，新鮮氣體流量 1. 5 L/min，連續(xù) 7 d; C 組吸入空氣 3 h; S 組于異氟醚暴露前 30 min 腹腔注射烏司他丁 50 000 U/kg。

1． 3 Morris 水迷宮實驗和曠場試驗（儀器均由上海欣軟信息科技有限公司提供） 末次暴露結(jié)束后 24 h 進行 Morris 水迷宮實驗和曠場試驗。在定位航行實驗中，記錄小鼠游泳速率和潛伏期。在定位航行試驗第 4 天完成之后行空間探索試驗。此時平臺從第Ⅰ象限移除。小鼠從定位航行實驗平臺放置象限相對的象限即第Ⅲ象限入水，每次進入小鼠游泳 60 s 后停止。記錄目標(biāo)象限穿越次數(shù)和目標(biāo)象限停留時間。

曠場試驗持續(xù) 3 d。從小鼠放置在中央格時計時，每次記錄 15 min。記錄中央?yún)^(qū)停留時間、周邊區(qū)停留時間、總路程及平均速率。

1． 4 白細胞介素 － 6 ( IL － 6 ) 、白細胞介素 － 1β( IL －1β) 和腫瘤壞死因子 － α( TNF － α) 含量測定 認知功能測試完畢后立即處死小鼠，剝離雙側(cè)海馬組織，存于－ 80℃ 冰箱，采用 ELISA 法測定海馬 IL － 6、IL － 1β 和TNF － α 含量。稱重海馬，稀釋至 400 μL，按試劑盒說明書步驟操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度以及相對應(yīng)的吸光值( OD450值) 通過 Curve Expert1． 3 軟件分析作出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，根據(jù)酶標(biāo)儀檢測得到樣品的，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程式計算海馬 IL － 6、IL － 1β 和 TNF － α 含量。

1． 5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用 SPSS 16. 0 統(tǒng)計軟件，計量資料組間比較采用成組 t 檢驗。

3 討論

探討圍手術(shù)期 POCD 發(fā)生的原因，以及避免和防范 POCD 成為亟待解決的問題。18 月齡的 C5 /7 小鼠相當(dāng)于人類中老年期，因此本研究選用 18 月齡鼠作為研究對象，以期了解異氟醚對老年鼠學(xué)習(xí)記憶的損害。根據(jù) ＲAMMES 的研 究，小 鼠 異 氟 醚 MAC 值 在( 1. 33 ± 0. 16) % ，因此本研究采用 1% 異氟醚濃度 3 h麻醉暴露方案。

Morris 水迷宮是應(yīng)用于腦學(xué)習(xí)記憶機制研究的一種實驗手段，在學(xué)習(xí)記憶﹑新藥研發(fā)﹑海馬 /外海馬研究﹑藥理學(xué)﹑毒理學(xué)等應(yīng)用非常普遍。曠場試驗是一種經(jīng)典評價動物行為學(xué)的實驗?zāi)Ｐ停饕从硠游镌谛颅h(huán)境的自主行為和探究行為。本研究中 Morris 水迷宮結(jié)果和曠場試驗結(jié)果提示，I 組老年小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力和空間探索能力均較對照組降低，而 S 組與 C 組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明烏司他丁可減輕異氟醚暴露所致老年小鼠學(xué)習(xí)探索和記憶能力的損傷。

本研究結(jié)果表明，烏司他丁預(yù)先給藥可改善異氟醚暴露致老年小鼠認知功能障礙，其機制可能與減少海馬炎性因子的過度釋放有關(guān)。神經(jīng)細胞炎性因子( IL － 1β、TNF － α 和 IL － 6 等) 釋放能夠?qū)е抡J知功能減退。炎性因子釋放可抑制海馬長時程增強，而海馬長時程增強是海馬學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵。另外，IL － 1β能夠激活 Caspase － 3，從而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，可通過IL － 1β / Caspase － 3 / 神經(jīng)凋亡途徑損害認知功能。而烏司他丁能調(diào)節(jié)全身炎癥反應(yīng)，抑制促炎性細胞因子的釋放、促進**性細胞因子的釋放。烏司他丁是從人尿液中分離純化的廣譜蛋白酶抑制劑，可有效抑制多種蛋白酶、糖苷酶、脂水解酶的活性。在膿毒癥、休克及心、肺、肝、腸的缺血再灌注損傷中，烏司他丁具有明顯的抑制炎癥因子釋放、保護組織臟器功能的作用。有研究表明在腦缺血再灌注模型的體內(nèi)外實驗中，烏司他丁能夠減少腦缺血再灌注損傷。另一項研究證實，在神經(jīng)病理性疼痛模型中，烏司他丁可抑制 IL － 1β、TNF － α 等炎癥因子釋放，拮**性因子造成的慢性神經(jīng)病理性疼痛。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，I 組海馬 IL － 1β 和 TNF － α 含量升高，提示

異氟醚麻醉可促進老年小鼠海馬炎性反應(yīng)，導(dǎo)致其認知功能降低。機制可能與異氟醚導(dǎo)致細胞內(nèi)鈣離子濃度升高，激活 NF － κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進炎性反應(yīng)有關(guān)。而烏司他丁預(yù)先給藥組促炎性細胞因子IL － 1β、TNF － α 的濃度明顯降低，可明顯減輕與神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)的神經(jīng)認知功能損傷。