【摘要 】 目的 觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)局灶性腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響 。 方法 33只 SD大鼠分成假手術(shù)組 ( n = 10) ,模型組 ( n = 11)和補(bǔ)陽(yáng)還五湯組 ( n = 12) 。 線栓法誘導(dǎo)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型 ,術(shù)前 7 d開(kāi)始灌胃 (13. 3 g/kg) ,連續(xù)給藥 21 d, 1次 /d。 缺血后第 1～28天進(jìn)行神經(jīng)癥狀評(píng)分 ,第 30～35天采用八臂迷宮評(píng)價(jià)學(xué)習(xí)記憶功能 。 結(jié)果 缺血后第 32、34和 35天 ,補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠總錯(cuò)誤次數(shù)分別為(3. 21 ±0. 47)次 、 (1. 94 ±0. 59)次和 (1. 48 ±0. 51)次 ,參考記憶錯(cuò)誤次數(shù)分別為 (2. 46 ±0. 52)次 、(1. 44 ±0. 53)次和 (1. 15 ±0. 57)次 ,與模型組比較差異有顯著性 ( P < 0. 05) ,但補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)沒(méi)有影響 ( P > 0. 05) ;補(bǔ)陽(yáng)還五湯在缺血后 14 d內(nèi)能顯著改善神經(jīng)癥狀 ( P < 0. 05或 P < 0. 01) 。結(jié)論 補(bǔ)陽(yáng)還五湯能顯著改善腦缺血恢復(fù)期大鼠學(xué)習(xí)記憶能力 。
【關(guān)鍵詞 】 局灶性腦缺血 ; 學(xué)習(xí) ; 工作記憶 ; 參考記憶 ; 補(bǔ)陽(yáng)還五湯；八臂迷宮實(shí)驗(yàn)

補(bǔ)陽(yáng)還五湯是臨床**腦缺血后遺癥的代表方劑 ,但目前有關(guān)補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血的實(shí)驗(yàn)研究主要集中在急性期 。 本研究進(jìn)一步觀察補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血恢復(fù)期學(xué)習(xí)記憶功能影響 。
材料與方法
一、材料
1. 動(dòng)物 : SD 大鼠 ,雄性 ,浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供 ,體質(zhì)量 250～300 g,二級(jí)動(dòng)物 ,自由飲食進(jìn)水 。
2.** :補(bǔ)陽(yáng)還五湯**來(lái)源《 醫(yī)林改錯(cuò) 》,黃芪120 g,當(dāng)歸 6 g,川芎 4. 5 g,赤芍 4. 5 g,地龍 3 g,紅花3 g,桃仁 3 g,藥材購(gòu)自浙江中醫(yī)學(xué)院附屬門診部并經(jīng)鑒定。

3.儀器：八臂迷宮實(shí)驗(yàn)裝置由上海欣軟信息科技有限公司提供。
二、方法
1. 線栓法誘導(dǎo)大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞模型 : 參照Longa等方法 ,大鼠用 100 g/L 水合氯醛腹腔麻醉(400mg/kg) 。 分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)和頸外動(dòng)脈 ,從頸外動(dòng)脈插栓線 (直徑約 0. 26mm)進(jìn)入頸內(nèi)動(dòng)脈直至大腦中動(dòng)脈 ,距頸總動(dòng)脈分叉處約 18～20mm。 缺血 90m in后將栓線緩慢拔出 ,結(jié)扎頸外動(dòng)脈。 術(shù)中用電熱板和白熾燈加溫 ,維持肛溫在 37℃左右 。 假手術(shù)組只分離血管 ,不插栓線。
2.分組與給藥 :采用完全隨機(jī)法將大鼠分成 3組。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組 ( n = 12) ,從術(shù)前 7 d開(kāi)始灌服補(bǔ)陽(yáng)還五湯 (13. 3 g/kg) ,持續(xù)到缺血后 14 d, 1次 /d。 假手術(shù)組 ( n = 10)和模型組 ( n = 11)灌服等量生理鹽水。
3. 神經(jīng)癥狀缺失評(píng)分 :采用 Longa等評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 。
4.八臂迷宮檢測(cè)學(xué)習(xí)記憶能力 :參照 Chen等方法。 迷宮距地面高 50 cm , 中 間八 邊形平 臺(tái)直 徑24 cm,臂長(zhǎng) 50 cm,寬 10 cm,高 50 cm。 在每個(gè)臂的頂端有一個(gè)強(qiáng)化用的食物杯 ,直徑 3 cm ,深 0. 5 cm。 在放迷宮的房間四周安放一些明顯的視覺(jué)標(biāo)志。 在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始和整個(gè)過(guò)程中限制進(jìn)食 ,控制大鼠的體質(zhì)量在自由飲食時(shí)的 80% ～85% ,自由飲水。 缺血后第 28、 29天適應(yīng)。 第 1天將餌散放在迷宮的八個(gè)臂內(nèi)和平臺(tái)上 ,每次放 2～3只大鼠 ,讓其自由進(jìn)食 。 第 2天開(kāi)始將餌只放在臂內(nèi) ,然后只放在食物杯內(nèi) ,使大鼠熟悉到杯內(nèi)
尋找食物 。 缺血后 30～35 d進(jìn)行學(xué)習(xí)獲得能力訓(xùn)練 。在迷宮的其中四個(gè)臂 (1、2、4、7號(hào)臂 )放入餌。 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前將大鼠放在中央平臺(tái) ,用一個(gè)不透明的塑料桶罩住 , 15 s后提起 ,讓大鼠在迷宮內(nèi)自由活動(dòng) ,當(dāng)大鼠將餌吃完或 5m in 后 ,實(shí)驗(yàn)結(jié)束 。 每天訓(xùn)練 4 次 ,連續(xù)6 d。 觀察指標(biāo) : (1)總錯(cuò)誤次數(shù) ,即大鼠進(jìn)入沒(méi)有餌的臂 (包括已吃完和未放餌的臂 )的次數(shù) ; (2)工作記憶錯(cuò)誤次數(shù) ,工作記憶錯(cuò)誤是指大鼠再次進(jìn)入開(kāi)始放有餌的臂 ; (3)參考記憶錯(cuò)誤次數(shù) ,參考記憶錯(cuò)誤是指大鼠第 1次進(jìn)入沒(méi)有放餌的臂。
5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 :數(shù)據(jù)用 x ±s表示 ,采用 SPSS10. 0軟件進(jìn)行非參數(shù) Mann2 W hitney u檢驗(yàn)。
結(jié) 果
一、補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)癥狀的影響補(bǔ)陽(yáng)還五湯在缺血后 1～14 d能明顯改善神經(jīng)癥狀。 其中在缺血后第 3, 5, 7天差異有非常顯著性 ( P< 0. 01) ,第 1, 14天差異有顯著性 ( P <0. 05) ,結(jié)果見(jiàn)表 1。
二、補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響
假手術(shù)組在訓(xùn)練結(jié)束后已基本學(xué)會(huì)。 與模型組比較 ,補(bǔ)陽(yáng)還五湯組在缺血后第 32, 34, 35天能顯著減少總錯(cuò)誤次數(shù)和參考記憶錯(cuò)誤次數(shù) ( P < 0. 05) ,但對(duì)工作記憶錯(cuò)誤次數(shù)沒(méi)有影響 ( P >0. 05) ,結(jié)果見(jiàn)表 2～ 表 4。

討 論
迄今為止 ,尚無(wú)一種普遍滿意的測(cè)試學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)模式 ,常用方法有 Y迷宮 、水迷宮等。 相對(duì)而言 ,八臂迷宮操作簡(jiǎn)便 、可行 ,而且能區(qū)分短期的工作記憶和長(zhǎng)期的參考記憶 ,現(xiàn)已被廣泛用于學(xué)習(xí)記憶功能評(píng)價(jià) 。
大腦中動(dòng)脈阻塞后 ,缺血大鼠感覺(jué)運(yùn)動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶能力明顯下降 ,這與 Ellsworth等報(bào)道一致。 我們根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 ,結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道 ,選擇給藥劑量13. 3 g/kg連續(xù)灌胃 21 d,發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽(yáng)還五湯能顯著減少總錯(cuò)誤次數(shù)和參考記憶錯(cuò)誤次數(shù) ,提高腦缺血大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。 由于大鼠腦缺血后神經(jīng)癥狀恢復(fù)很快 ,補(bǔ)陽(yáng)還五湯只在缺血后 14 d內(nèi)能顯著改善神經(jīng)癥狀 ,缺血后第 28 d,已基本無(wú)運(yùn)動(dòng)障礙 。
腦缺血導(dǎo)致行為學(xué)缺失和恢復(fù)的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制還不清楚 。 急性期減少神經(jīng)元死亡和恢復(fù)期促進(jìn)神經(jīng)再生都有助于神經(jīng)功能恢復(fù)。 大鼠大腦中動(dòng)脈阻塞后VD小鼠海馬 CA1區(qū) CHAT及其 mRNA表達(dá)下降。 說(shuō)明兩者水平降低與 VD 發(fā)病有關(guān) ,至于其下降的可能原因 : ① 反復(fù)缺血 - 再灌注導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡 ; ② 前列腺凋亡反應(yīng) 4 (p rostate apop tosis response24, Par24)具有降低 CHAT蛋白質(zhì)水平、阻止細(xì)胞增加 CHAT活性的能力、激活 caspase家族半胱氨酸蛋白酶、誘導(dǎo)死亡基因的表達(dá)等作用 [ 5、 6 ] ,而 Par24在腦缺血后含量升高 。因此研究中 CHAT及其 mRNA 的下降可能與反復(fù)缺
血 - 再灌注使 Par24水平升高有關(guān) 。 ③CHAT受鈣調(diào)素激酶 Ⅱ 等蛋白激酶的磷酸化調(diào)節(jié) ,這種磷酸化作用可以調(diào)節(jié) CHAT的活性 。呂佩源等曾研究發(fā)現(xiàn)VD小鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞鈣調(diào)素激酶 Ⅱ的 mRNA 表達(dá)下降 ,因此 , CHAT及其 mRNA表達(dá)降低與鈣調(diào)素激酶 Ⅱ的 mRNA低表達(dá)有關(guān)。
石杉?jí)A甲作為一種促智藥 ,傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為其高效 、可逆抑制膽堿酯酶 ,進(jìn)而改善癡呆者認(rèn)知功能 。 現(xiàn)今認(rèn)為其具有多重藥理作用。 首先它具有抗氧自由基 、抗細(xì)胞凋亡 、抗谷氨酸受體等神經(jīng)保護(hù)作用 ,因此 ,該藥通過(guò)糾正海馬神經(jīng)細(xì)胞缺血、缺氧狀態(tài) ,改善了CHAT及其 mRNA的表達(dá) ;其次 ,呂佩源等曾研究發(fā)現(xiàn)石杉?jí)A甲能顯著改善 VD小鼠海馬鈣調(diào)素激酶 Ⅱ的mRNA的表達(dá) ,增高的鈣調(diào)素激酶 Ⅱ通過(guò)其磷酸化作用 ,進(jìn)一步增強(qiáng)了 CHAT的活性。
綜上所述 ,海馬神經(jīng)元 CHAT及其 mRNA 的表達(dá)降低參與了 VD 的發(fā)病 ,石杉?jí)A甲通過(guò)多靶點(diǎn)的藥理機(jī)制 ,提高了海馬兩者的表達(dá) ,改善了 VD 小鼠海馬的膽堿能系統(tǒng)功能 ,進(jìn)而提高了 VD 小鼠的學(xué)習(xí)、記憶成績(jī)。