摘要: 目的 測評環境相關恐懼模型大鼠的行為學變化及疏肝清熱健脾法的干預效果。方法 以環境相關恐懼刺激法建立廣泛性焦慮大鼠模型，造模同時進行**干預，應激結束后以高架十字迷宮試驗進行測評，評價該模型的行為學變化及疏肝清熱健脾法的干預效果。結果 造模結束后的大鼠易激惹，運動活力降低，高架十字迷宮測試開放臂活動次數及時間減少，封閉臂活動傾向增多。**組比模型組整體運動活力提高，開放臂活動次數及時間增多，封閉臂活動傾向減少。結論 環境相關恐懼模型大鼠的行為學表現出明顯的焦慮，能夠較好模擬廣泛性焦慮的發病狀態，疏肝清熱健脾法可降低該模型大鼠的焦慮水平。
關鍵詞: 環境相關恐懼模型; 廣泛性焦慮障礙; 行為學; 疏肝清熱健脾; 大鼠
焦慮癥是一類以恐懼、擔憂、緊張不安等焦慮情緒為核心癥狀的神經癥，主要包括急性發作的驚恐障礙( Panic disorder，簡稱 PD) 和慢性病程的廣泛性焦慮障礙( generalized anxiety disorder，簡稱 GAD)。
隨著現代社會生活節奏的加快，GAD 的發病日趨普遍。其慢性病程、易復發、影響生活質量等特點，對人類身心健康的危害較大，因而對 GAD 的發病機制、防治措施開展深入研究**必要性和緊迫性。本研究用環境相關恐懼應激方法建立廣泛性焦慮大鼠模型，并通過對大鼠行為學變化的觀察、測評，對中藥疏肝清熱健脾法的干預作用進行探討。
1 實驗材料
健康 Wistar 雄性大鼠 48 只，SPF 級，10 周齡，體質量( 200 ±10) g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號: SCXK( 京) 2010-0001。動物購進后飼養于 SPF 級實驗動物中心，自由攝食飲水，光照節律12L/12D( 6: 00 ～18: 00) ，室溫( 20 ±2) ℃，相對濕度 50% ～60%，保持安靜。高架十字迷宮( 開放臂 50 cm ×10 cm，閉合臂 50 cm × 10 cm × 40 cm，中央區 10 cm ×10 cm) 由上海欣軟信息科技有限公司生產，產品型號為: XＲ-XG201。Xmaze 實驗動物行為學視頻分析系統，由上海欣軟信息科技有限公司生產，與高架十字迷宮設備配套。聲電刺激儀，由上海軟隆科技發展有限公司生產。丹梔逍遙散( 柴胡 15g，梔子10 g，牡丹皮 10 g，炒白術 15 g 等) 購于北京中醫藥大學第三附屬醫院，造模前按大鼠用量 10. 5 g/ ( kg·d) ，灌胃劑量每次 2 mL 煎煮，煎取后濃縮至生藥濃度 1. 05 g/mL，貯存于 4 ℃冰箱冷藏備用，灌胃前以溫水隔水加熱。鹽酸丁螺環酮( 商品名: 一舒，江蘇恩華藥業股份有限公司，批準文號: 國藥準字H19991024) ，按**用量 20 mg / ( 70 kg·d) 的 7 倍、灌胃劑量每次2 mL計算大鼠用量 2．0 mg/( kg·d) ，以濃度0．20 mg/mL 溶于蒸餾水中，灌胃前混勻。
2 實驗方法
2. 1 動物分組與給藥 動物預養 1 周后，首先將 48只動物進行曠場試驗，以水平運動總格數與直立次數( 垂直運動) 之和為參考，按正態分布去掉置信區間95% 以外的大鼠 8 只，剩余 40 只大鼠按水平運動與垂直運動之和隨機分為正常組、模型組、對照組、**組，每組 10 只。自造模第 1 天起，正常組不予任何處理，自由攝食、飲水，模型組予以蒸餾水灌胃，對照組予以丁螺環酮水溶液灌胃，**組予以中藥丹梔逍遙散濃縮藥汁灌胃，連續 21 d。
2. 2 模型制備 動物預養及分組結束后，模型組、對照組、**組與灌胃同步進行環境相關恐懼模型的制備。本模型制備分 3 個階段進行應激，第 1 階段為條件性訓練( 1 d) ，給予大鼠條件性刺激，程序為“無刺激 180 s→聲音信號 30 s→足底電擊 2 s→無刺激20 s”，訓練 10 次; 第 2 階段為環境相關( 2 d) ，將大鼠放入**階段環境中，評價環境相關的條件性恐懼程度，程序為“無刺激180 s”; 第3 階段為改變的環境信息( 2 d) ，改變環境信息后觀察大鼠的條件性恐懼程度，程序為“無刺激 180 s→聲音信號 180 s→無刺激6 s”。以上流程循環 4 次，共 20 d。聲電刺激儀設定電流為 1. 2 mA，聲音信號采用“滴滴”樣相同頻率聲音。模型制備同時，觀察并記錄大鼠僵滯時間，僵滯時間記錄由 3 名觀察者觀察結果平均而得。模型制備期間，3 組大鼠的應激操作于每天 8: 00 ～ 11: 30進行，應激前大鼠提前 30 min 進入應激實驗室適應環境，操作時抓取動物輕柔。
2. 3 高架十字迷宮測試 行為學實驗室保持安靜通風，恒溫 22 ℃，濕度 50% ～60%，室內暗光，光線自天花板反射到高架十字迷宮測試區。迷宮由兩個開放臂( 50 cm × 10 cm) 、兩個封閉臂( 50 cm × 10 cm × 40cm) 、一個連接四臂的中央平臺( 10 cm × 10 cm) 組成，開放臂與封閉臂互相垂直成十字形。測試前動物提前60 min 進入房間適應環境，測試時實驗人員輕柔抓取大鼠并迅速輕放入 EPM 中央平臺處，放置時使大鼠頭部正對其中一個開放臂，每只大鼠測試時間 5 min，各組交叉進行，測試時攝像視頻系統記錄大鼠行為表現，實驗人員可通過顯示器觀察大鼠迷宮上的活動，每只大鼠測試結束后將排泄物**干凈，并以酒精擦拭迷宮底部，以免影響下只大鼠行為表現。高架十字迷宮測試于造模結束次日 15: 00 ～18: 00 進行，所有大鼠測試結束后，統一分析視頻，記錄并整理大鼠進入開放臂次數、進入開放臂時間、進入封閉臂次數、進入封閉臂時間、探頭次數、直立次數、修飾次數、排便次數，并計算進入開放臂與封閉臂次數之和、開放臂次數占總次數百分比、開放臂時間占總時間百分比。
2. 4 統計方法 數據采用 SPSS 18. 0 統計軟件分析處理，各組數據用均數 ± 標準差(珋x ± s) 表示。組內比較用重復測量方差分析，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性，驗后多重比較采用 LSD 法，以P ＜0. 05表示差異有統計學意義。
3 實驗結果
3. 1 造模期間恐懼消退觀察 模型制備過程中，模型組、對照組、**組在每個流程中均表現出電擊刺激撤除后的恐懼消退，模型組、對照組、**組僵滯時間占總時間百分比第 2，7，12，17 天組間比較無差異;對照組僵滯時間占總時間百分比第 4，5，8，9，10，13，14，15，18，19，20 天比模型組減少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，**組僵滯時間占總時間百分比第 8，9，10，13，14，15，18，19，20 天比模型組減少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ;**組僵滯時間占總時間百分比與對照組比較，第2，3，4，7，12，15，17，18，19，20 天差異無統計學意義，第 5，8，9，10，13，14 天**組高于對照組( P ＜0. 05，P ＜ 0. 01) 。對照組從第 1 個流程開始( 第 4 天起) 表現出僵滯時間較模型組有差異，**組從第 2 個流程開始( 第 8 天起) 僵滯時間較模型組有差異。結果見圖 1。
模型組、對照組、**組組內僵滯時間占總時間百分比流程間的比較顯示: 第 2，7，12，17 天( 即每個流程第 2 天) 、第 3，8，13，18 天( 即每個流程第 3 天) 、第4，9，14，19 天( 即每個流程第4 天) 及第 5，10，15，20天( 即每個流程第5 天) 比較差異均無統計學意義。
3. 2 造模結束后一般情況及體質量變化觀察 造模結束后肉眼觀察 4 組大鼠神態、毛發、飲食、糞便性狀，結果見模型組、對照組、**組大鼠較正常組大鼠神態懶倦，毛發無光澤，飲食欠積極，活動欠活躍，易激惹，少數大鼠見溏便。且 3 組大鼠與正常組大鼠對比之差別以模型組尤甚，對照組及**組次之。造模第 1，2，3 天 4 組大鼠體質量無差異，自第 4 天起至造模結束，正常組與模型組、對照組、**組比較有差異( P ＜0. 05，P ＜0. 01) ，其中自第 8 天起差異明顯，正常組高于其余 3 組( P ＜0. 01) 。對照組與模型組第 9天起 至 造 模 結 束 有 差 異，對 照 組 高 于 模 型 組( P ＜0. 05，P ＜0. 01) ，**組與模型組第 7 天起至造模結束有明顯差異，**組高于模型組( P ＜ 0. 01) 。**組與對照組比較第 9 天起至造模結束有差異，**組高于對照組( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，且第 13 天起至造模結束有明顯差異( P ＜0. 01) 。結果見圖 2。
3. 3 高架十字迷宮測試 與正常組比較，模型組、對照組、**組開閉臂活動總次數、開臂活動次數所占比例、開臂活動時間所占比例均減少 ( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) 。對照組開閉臂活動總次數、開臂活動次數所占比例、開臂活動時間所占比例比模型組增多( P ＜0. 05，P ＜0. 01) 。**組開閉臂活動總次數、開臂活動次數所占比例、開臂活動時間所占比例比模型組明顯增多( P ＜0.01) 。**組開閉臂活動總次數、開臂活動次數所占比例、開臂活動時間所占比例與對照組比較差異無統計學意義。結果見表 1。
與正常組比較，模型組、對照組、**組探頭、直立次數均減少( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，修飾、排便次數比正常組增多( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ; 對照組探頭、直立次數比模型組增多( P ＜ 0. 05，P ＜ 0. 01) ，修飾、排便次數比模型組減少( P ＜0. 05) ; **組探頭、直立次數比模型組明顯增多( P ＜0. 01) ，修飾、排便次數比模型組減少( P ＜0. 05) ; **組探頭、直立、修飾、排便次數均與對照組比較差異無統計學意義。結果見表2。
4 討論
環境相關恐懼模型因刺激信號非明確及刺激不可預知被認為可以較好地模擬彌散而持續的焦慮狀態，適合作為 GAD 的實驗動物模型。該模型制備過程中動物的僵滯時間可反映實驗動物條件性恐懼記憶的消退程度。高架十字迷宮試驗是經典的可以有效測量實驗動物焦慮水平的行為學測試方法。通過對環境相關恐懼模型的制備發現，每個刺激流程大鼠均表現出恐懼記憶的消退，應激后的大鼠易激惹、運動活力降低，高架十字迷宮測試中開臂活動次數及時間相對減少，提示該模型大鼠焦慮狀態明顯。
中醫學沒有 GAD 的病名，依據 GAD 的病因及臨床表現，將其歸屬于情志**范疇。依照具體的臨床表現，中醫辨證認為，該病病位主要在肝、心、脾、腎，病理因素見火、痰、濕、瘀多種，所涉證型有肝郁化火、心腎不交、肝郁脾虛、心脾兩虛等，其中肝郁化火證型尤為常見。根據五行“木克土”及“見肝之病，知肝傳脾”理論，GAD 屬肝郁者往往伴有或引發脾虛，臨床所見 GAD 患者往往伴神疲、乏力、倦怠、納減等脾虛表現，疏肝清熱健脾法因而被選作本研究的治法。丹梔逍遙散以逍遙散加牡丹皮和梔子而成方，功可疏肝健脾、清熱解郁。
從模型制備過程中對僵滯時間的觀察可見，各組在每個流程不同應激階段的僵滯時間所占百分比組內比較差異無統計學意義，提示大鼠在本模型制備過程中未表現出對恐懼記憶的長期記憶效果，考慮與每個流程條件性訓練后的恐懼消退有關。組間比較顯示，中藥疏肝清熱健脾法與丁螺環酮均可降低大鼠處于應激環境中的僵滯時間，提示兩者對恐懼記憶的消退均有鞏固作用，但疏肝清熱健脾法比丁螺環酮起效慢。行為學測評結果顯示疏肝清熱健脾法與丁螺環酮均可提高該模型大鼠的運動活力，有效降低焦慮水平，并且從行為學各項指標來看，兩者干預效果比較差異無統計學意義。但**組高架十字迷宮測試中直立次數的增多均較對照組更明顯，且**組體重情況優于對照組，因此認為疏肝清熱健脾法具有與丁螺環酮同等的抗焦慮效果，且在大鼠綜合體質及精神狀態改善方面優于丁螺環酮。李寧等以不確定性空瓶刺激建立 GAD 模型，并以丹梔逍遙散進行干預，結果顯示丹梔逍遙散抗焦慮效果優于丁螺環酮，與本研究結果有異，考慮可能與模型應激方式不同有關，另也應與丁螺環酮的給藥天數不同而致起效不同有關。
概言之，通過環境相關恐懼應激的方法建立模型，可以造成大鼠明顯的焦慮狀態，雖然條件性訓練階段電擊對實驗動物有軀體刺激，但在環境相關恐懼刺激階段及改變的環境信息階段均避免軀體應激成分，而且環境信息的不確定性有利于引發動物情緒泛化，易于產生彌散而持續的焦慮，因而較好地模擬GAD 的發病狀態。疏肝清熱健脾法與丁螺環酮在行為學上均表現出肯定的抗焦慮效果，前者在動物整體體質狀態改善方面效果更優。但該模型作為 GAD 實驗動物模型具體的神經病理改變仍有待探索，中藥的作用機制亦有待更深入的研究。
