摘要: 目的: 探討胞二磷膽堿對***麻醉致幼期大鼠長期認知功能損害的**作用。方法: 54 只雄性PND7 大鼠幼鼠根據出生時間和處理方式分成 9 組: ①14 d 對照組( C14d組) 、14 d ***組( K14d組) 、14 d 異氟烷 + 胞二磷膽堿組( K + C14d組) ; ②30 d 對照組( C30d組) 、30 d ***組( K30d組) 、30 d *** + 胞二磷膽堿組( K + C30d組) ; ③60 d 對照組( C60d組) 、60 d ***組( K60d組) 、60 d *** + 胞二磷膽堿組( K + C60d組) 。K14d組、K30d組、K60d組、K + C14d組、K + C30d組和 K + C60d組均在生后第 7 天、第9 天、第11 天、第13 天腹腔注射*** 70mg/kg，C14d組、C30d組和 C60d組在出生 7 d 后，腹腔注射生理鹽水( 0． 5 ml，1 次/d，連續 7d) 。K + C14d組、K + C30d組、K + C60d組大鼠在腹腔注射***后當天腹腔注射胞二磷膽堿500 mg/kg( 0． 5ml，1 次 / d，連續 7 d) 。大鼠分別在出生后 14d、30 d 和 60 d 進行條件恐懼實驗測試認知功能。結果: 條件恐懼實驗結果: 條件關聯和條件暗示測試中，在出生后第 14 天，K14d組和 K + C14d組兩組間的恐懼凝滯時間差異無統計學意義( P ＞0．05) ，但均短于 C14 d 組大鼠( P ＜0． 05) ; 在出生后第 30 天，K30d組短于 C30d組和 K+ C30d( P ＜0． 05) ，C30d組與 K + C30d組差異無統計學意義( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d組短于 C60d組和K + C60d( P ＜0． 05) ，C60d組與 K + C60d組差異無統計學意義( P ＞0． 05) 。結論: 多次***( 70 mg/kg) 腹腔注射麻醉可引起幼期大鼠長期的學習記憶能力損害; 胞二磷膽堿腹腔注射可抑制***麻醉對幼期大鼠學習記憶能力的損害。

關鍵詞: ***; 學習記憶; 胞二磷膽堿; 認知功能障礙

***是臨床上( 尤其嬰幼兒麻醉) 常用的全身***。雖然***在大腦缺血等腦損害中有明顯的抗損傷保護作用，但*近研究提示***麻醉可以誘導處于腦發育期的大鼠腦神經元凋亡以及成年期后學習記憶改變。這提示幼期( 出生后早期或胎兒期) 經歷麻醉對大腦學習能力的發育是一個危險因素。目前，對麻醉誘致的認知功能損害尚無有效的防治辦法。胞二磷膽堿是細胞膜磷脂生物合成所需的中間物，基本結構包含胞苷和膽堿兩部分。有研究提示，胞二磷膽堿可通過多途徑抑制神經元凋亡，促進受損害的神經元修復。但胞二磷膽堿應用于**麻醉所致的神經損傷及認知功能損害少有報道。本研究擬通過應用***麻醉出生后 7 d( postnatal days 7，PND7) 的大鼠幼鼠，觀察***麻醉對大鼠幼鼠認知功能的影響及腹腔注射胞二磷膽堿對***麻醉所致的認知功能損害的**作用。

1 材料和方法

1． 1 動物和分組 54 只雄性 PND7 大鼠幼鼠分組( 共 9 組，每組 6 只) : ①14 d 對照組( C14d組) 、14 d ***組( K14d組) 、14 d *** + 胞二磷膽堿組( K +C14d組) 。若同窩內雄性幼鼠 ＜ 3 只，該窩大鼠不納入實驗; 若同窩內雄性幼鼠≥3 只，1 只分至 C14d組、1 只分至 K14d組、1 只分至 K + C14d組; 若同窩內雄性幼鼠≥6 只，2 只分至 C14d組、2 只分至 K14d組、2 只分至 K +C14d組，以此類推分組。②30 d 對照組( C30d組) 、30 d***組( K30d組) 、30 d *** + 胞二磷膽堿組( K +C30d組) ; ③60 d 對照組( C60d組) 、60 d ***組( K60d組) 、60 d *** + 胞二磷膽堿組( K + C60d組) 。②、③分組辦法同①。

1． 2 麻醉處理和**注射 C14d組、C30d組和 C60d組，K14d組、K30d組、K60d組、K + C14d組、K + C30d組和 K + C60d組均在生后第 7 天、第 9 天、第 11 天、第 13 天腹腔注射*** 70 mg/kg( 0． 5 ml) 。K + C14d組、K + C30d組、K + C60d組大鼠在腹腔注射***后當天腹腔注射胞二磷膽堿 500 mg/kg( 0． 5 ml，1 次/d，連續 7 d) ，其余所有大鼠均腹腔注射生理鹽水 0． 5 ml( 1 次/d，連續 7d) 。麻醉期間將大鼠置于棉墊上，棉墊底部墊有電加熱毯，調節并控制受試動物體溫為38 ～39 ℃。麻醉復蘇后剪耳標記并放回母籠飼養，分別在出生后14 d、30d 和 60 d 進行學習和記憶能力測試。在飼養過程中若同窩配對 3 只中任一大鼠死亡，配對中另 2 只亦剔出該實驗，另擇符合條件動物加入補充。

1． 3 條件恐懼實驗 采用條件性恐懼實驗系統( XＲ-XC404 型，上海欣軟信息科技有限公司) 進行測試。測試分兩天進行: 第 1 天，在 3 min 的適應探索期后給予 3 次聲音( 2 000 Hz，90 dB，30 s) + 電流刺激( 1mA，2 s; 電流刺激在聲音的*后 2 s 開始，與聲音同時結束) ，3 次聲音間隔為 1 min; 第 2 天進行條件關聯實驗( contextual fear conditioning，context) 和條件暗示實驗( cued fear conditioning，cue) 。在 context 實驗中，大鼠置于一個與第 1 天實驗相同的場景中，無聲音和電流刺激，錄像 8 min; 在 cue 實驗中，大鼠置于一個與第1 天實驗不同環境的方盒中，在 3 min 的適應探索期后給予 3 次聲音( 2 000 Hz，90 dB，30 s，無電流刺激) ，3次聲音間隔為 1 min，錄像 8 min。圖像分析軟件自動計算統計 context 和 cue 實驗中大鼠的凝滯時間及所占時間百分比。

1． 4 統計學處理 應用 SPSS 15． 0 統計軟件分析數據，定量資料用均數 ± 標準差( x－± s) 表示。采用單因素方差分析進行比較。P ＜ 0． 05 為差異有統計學意義。

2 結果

2． 1 條件關聯測試結果 在出生后第 14 天，K14d組和 K + C14d組恐懼凝滯時間差異無統計學意義( P ＞0． 05) ，但均短于 C14d組大鼠( P ＜ 0． 05) ; 在出生后第30 天，K30d組短于 C30d組和 K + C30d組( P ＜0． 05) ，K30d組與 K + C30d組差異無統計學意義( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d組短于 C60d組和 K + C60d組 ( P ＜0． 05) ，K60d組與 K + C60d組差異無統計學意義( P ＞0． 05) 。見表 1。

2． 2 條件暗示測試結果 在出生后第 14 天，K14d組和 K + C14d組兩組間的恐懼凝滯時間差異無統計學意義( P ＞0． 05) ，但均短于 C14d組大鼠( P ＜ 0． 05) ; 在出生后第 30 天，K30d組短于 C30d組和 K + C30d組( P ＜0． 05) ，K30d組與 K + C30d組差異無統計學意義( P ＞0． 05) ; 在出生后第 60 天，K60d組短于 C60d組和 K + C60d組( P ＜0． 05) ，K60d組與 K + C60d組差異無統計學意義( P ＞0． 05) 。

3 討論

條件恐懼實驗系統又名場景恐懼系統，是檢測嚙齒類動物對環境相關條件性恐懼的學習記憶能力的實驗，是評價大鼠學習記憶能力常用方法之一。大鼠在恐懼時會表現出特有的行為凝滯狀態( Freezing，動物特有的、靜止不動的防御姿勢) 。條件恐懼實驗分環境聯系( 條件關聯，context) 實驗和聲音信號實驗( 條件暗示，cue) 兩部分。Context 實驗中的凝滯時間反映大鼠海馬依賴的學習記憶能力，cue 實驗中的凝滯時間反映大鼠非海馬依賴的學習記憶能力。測試中凝滯時間 延 長 為 促 進 記 憶，凝 滯 時 間 縮 短 為 記 憶損害。

大鼠大腦發育的高峰期主要是出生后 2 周內( 相當于人類的 3 歲以內) ，此高峰期也是神經元突觸形成建立的關鍵期。因此在此關鍵期內，大腦的發育狀況將直接影響成年期后的大腦功能的**功能。有研究表明，***麻醉可能對 PND 大鼠海馬神經元有促進凋亡的作用，并影響其學習記憶能力，這種影響還可能與麻醉時間有關。因此，本研究選擇處于大腦發育期的 PND7 大鼠作為研究對象，對其進行***腹腔注射麻醉。有研究表明，低于 50 mg/kg 劑量、重復少于 3 次的腹腔***注射麻醉對幼鼠長期學習記憶能力無明顯損害。實驗結果提示 70 mg/kg ***麻醉對海馬依賴和非海馬依賴的學習記憶能力均有明顯損害作用; 而且***麻醉對 PND7 大鼠學習記憶能力損害比較持久( 可致出生后 60 d 或更久) 。

突觸是神經元信息傳遞的結構基礎，**神經元以突觸的形式形成神經元網絡對學習和記憶能力的發育極為重要。學習記憶功能與海馬神經元的數量之間存在著依賴關系。有研究表明，***麻醉能夠影響新生大鼠的突觸發育，并且影響其學習記憶功能。

胞二磷膽堿是常用的**神經保護劑。有研究表明，胞二磷膽堿對大鼠腦缺血損傷后的認知功能損害有明顯的**作用。本研究結果顯示，腹腔***注射麻醉 PND7 大鼠期間連續 7 d 應用 500 mg/kg胞二磷膽堿腹腔注射，至出生后 30 d 可使大鼠學習記憶能力恢復至正常水平，提示胞二磷膽堿可以明顯抑制***麻醉對 PND7 大鼠學習記憶能力損害作用。

綜上所述，多次***( 70 mg/kg) 腹腔注射麻醉對幼期大鼠的學習記憶能力損害能持續至成年( 出生后 60 d 或更久) ; 胞二磷膽堿腹腔注射可抑制***麻醉對幼期大鼠學習記憶能力的損害。