眾多研究和臨床實踐表明, 腦內DA 系統與動物的運動、學習、記憶、情緒等活動有密切關系。帕金森病 ( Park in son ’ s d isease, PD ) 就是原因不明的黑質DA 能神經元變性丟失, 導致紋狀體內DA 釋放量減少, 從而出現僵直、靜止性震顫和運動障礙等癥狀, 并伴有癡呆發生。目前PD 大鼠模型大多以**誘導的旋轉實驗作為建模成功與否的觀察指標, 但此時黑質DA 能神經元丟失80% 左右, 紋狀體DA 含量下降超過 90% , 相當于臨床PD 晚期。利用開野實驗作為行為學觀察指標, 動態觀察黑質DA 能神經元形態學變化與行為改變之間的關系, 相關報道還不多見。本實驗利用 6-O HDA 特異毀損大鼠單側黑質DA 能神經元, 在不同時間點觀察DA 能神經元的病理變化, 丟失比例和行為學改變, 分析兩者之間的相關性, 以期為 PD 早期模型提供行為學評價指標, 為 PD 早期病理改變和神經生化研究提供指導。

1　材料與方法

1. 1 　 儀 器 及 主 要 試 劑 　 腦立體定位儀 , 微量推進器  , SuperMaze動物行為圖像分析系統  , 曠場實驗箱，6-O HDA 、酪氨酸羥化酶 抗體 , SABC、 DAB 。

1. 2 　實驗動物及分組　健康 Sp rague2 D aw ley雄性大鼠 60 只 ( 安徽醫科大學實驗動物中心提供) ,體重 210 ～ 240g , 隨機分為正常對照組 ( N C ) ( n =10) , 實驗對照組 ( EC ) ( n = 10) , 和實驗組 ( n = 40) ,后者按處死時間不同隨機分成 4 組, 每組 10 只。

1. 3 　 6-O HDA 毀 損 　 7% 水 合 氯 醛 ( ip ,350 m g/kg ) 麻醉大鼠, 頭顱水平位固定在腦立體定位儀上, 門齒溝平面比耳間線平面低2. 4 mm , 剪去頭部毛, 切開頭皮, 暴露顱骨前囟點 ( 若不清晰, 可用3% H 2 O 2 擦洗) , 參照包新民等

著《大鼠腦立體定位 圖 譜》確 定 右 側 SN c 區 坐 標 前 囟 后 (A P )- 5. 2 mm , 右側旁開 (R ) 1. 3 mm , 深度 ( V ) 8. 0 mm ,顱骨鉆孔后 ( 切勿損傷軟腦膜) , 1L l 微量注射器插入右側SN c 區, 注射8g /L 6-O HDA ( 溶于0. 2% V itC 生理鹽水溶液) 1L l, 利用微量推進器緩慢推進 ( 0. 5L l/m in ) 。注射完畢, 留針5 m in 后緩慢拔針, 縫合皮膚并肌注硫酸慶大霉素 ( 5 m g/kg ) 預防感染, 清醒后置籠喂養。 EC 組僅注射0. 2% V itC 生理鹽水溶液1L l , N C組不手術。

1. 4 　開場實驗 (op en 2 f ield test )

　敞口木箱60cm ×60cm ×40cm , 里面涂成黑色, 箱底劃為 25 個方格 ( 12 cm ×12cm ) , 將大鼠放入正中一格, 10 s 后開始記錄 15 m in 內各項行為指標。觀察指標: ( 1) 旋轉行為, 記錄左、右側旋轉的圈數, 按公式右側/( 左側+ 右側) 計算不對稱指數; ( 2) 探究行為, 鼻子距離箱壁 5cm 以內的跑動時間; ( 3) 穿梭距離, 規定時間內跑動的格子數 ( 二爪以上跨入鄰格為跑動一格) ;( 4) 下肢站立, 雙上肢抬起離地 1cm 以上的次數; ( 5)修飾次數, 理毛、洗臉、舔舐次數。在毀損術后1d 、 3d 、5d 、 7d 、 14d 、 21d 各觀察 1 次, 每次實驗均在 7: 00 ～12: 00 AM 進行, 實驗室內暗光、安靜, 兩次實驗之間將箱底打掃干凈。

1. 5　形態學觀察

1. 5. 1 　取材　分別在術后 1d 、 7d 、 14d 、 21d 行為學測試完畢, 7% 水合氯醛 ( ip , 350 m g/Kg) 麻醉大鼠, 置于冰盤上, 打開胸腔, 暴露心臟, 先用 0. 9%N aC l 100 m l 經心臟沖洗, 然后300 m l 4% 多聚甲醛灌注固定, 取出腦組織4% 多聚甲醛后固定24h。在針道旁冠狀面切開, 石蠟包埋, 連續切片, 片厚 6L m , 常規H E 染色。定位不在SN c 區的大鼠從該組剔除, 不進行統計學分析。

1. 5. 2　 N issl 染色　切片脫蠟至水, 0. 1% 硫堇冰醋酸水溶液染色15 ～ 20 m in, 95% 酒精快速分色 ( 2～ 3 s 即可) , 脫水、透明、封片、鏡檢。

1. 5. 3　**組織化學染色 ( ABC 法) 　切片脫蠟至水后經 3% H 2 O 2 滅活內源性過氧化物酶, 微波抗原修復 2 次, 正常山羊血清封閉 20 m in 后, 1 ∶500TH 一抗 4℃冰箱孵育過夜, 滴加生物素化二抗和 SABC 37℃各孵育 20 m in。其間, 各步驟間均用0. 01 mo l/L PBS (pH 7. 2) 充分洗滌, *后加DAB 顯色 ( 鏡檢控制顯色時間) , 常規脫水、透明、封片、鏡

檢。

1. 5. 4　電鏡觀察　灌注固定后, 分離黑質和紋狀體約 1 mm

3, 2. 5% 戊二醛、 1% 鋨酸雙重固定, 脫水, Epon 812 包埋, L KB- NOVA 切片機超薄切片,醋酸鈾枸櫞酸鉛雙重染色, 透射電鏡觀察。

1. 5. 5 　圖像分析　采用江蘇捷達圖像分析系統對切片進行圖像分析, 根據N issl 染色圈出黑質范圍, 采用同一放大倍數 ( ×100) , 同一光強度下測量陽性數密度, 并按照公式: 100- ( 右側細胞數/ 左側細胞數) ×100, 計算DA 能神經元毀損程度。

1. 5. 6 　統計方法　所有數據采用X ±s 表示,SPSS11. 5 統計軟件進行分析, 采用單因素方差分析( ANOVA ) 進行組間比較, *小有意義差異 t 檢驗( L SD -t) 進行組內兩兩比較, 開野實驗各參數與黑質DA 能神經元毀損比例作 Pear son’ s 相關分析。

2　結　果

2. 1　開場實驗結果　 ( 1) 旋轉行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 05) 。在術后 1d 右側旋轉行為增多 ( 與對照組比較P < 0. 05) , 3d 、 5d 恢復到對照組水平 ( P > 0. 05, 與 1d 、 14d 、 21d 組比較 P <0. 05 ) , 而后右側旋轉又逐漸占據優勢 ( 14d 、 21d 組與對照組比較 P < 0. 05) ; ( 2) 探究行為: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01) 。術后 1d 較對照組大幅減少( P < 0. 01 ) , 3d 、 5d 接近對照組水平 ( P > 0. 05, 與1d 、 7d 、 14d 、 21d 組比較 P < 0. 01 ) , 此后逐漸降至較低水平 ( 與對照組比較 P < 0. 01) ; ( 3) 穿梭距離: 組間比較差異有顯著性 ( P < 0. 01) 。實驗組變化趨勢呈正態分布, 1d 、 14d 、 21d 組與5d 組及對照組比較差異有顯著性 (P < 0. 01) , 5d 組與對照組比較差異無顯著性 ( P > 0. 05 ) ; ( 4) 下肢站立: 組間比較差異有顯著性 (P < 0. 01) 。各實驗組與對照組比較差異均有顯著性 (P < 0. 01) , 3d 、 5d 組也有恢復傾向 ( 與 1d 、21d 組比較 P < 0. 05 ) , 但與對照組相比仍處于較低水平; ( 5) 修飾行為: 變化沒有規律性, 組間比較差異

無顯著性 (P > 0. 05) 。

2. 2　形態學觀察結果　 ( 1) H E 染色和N issl 染色顯示, 從 1d ～ 21d 大鼠 6-2 O HDA 注射側SN c 區神經元較對側明顯減少, 尼氏體著色較對側淡, 針道及毀損區可見不同程度膠質細胞浸潤, 對照組左右側細胞數均無明顯變化。( 2) **組化染色顯示 , TH 陽性神經元隨時間推移逐漸減少, 毀損比例不斷增大, 沒有恢復傾向, 對照組無明顯變化。( 3) 電鏡結果從1 ～ 21d 大鼠黑質神經元超微結構損傷逐漸加重, 線粒體腫脹、嵴

消失, 粗面內質網和高爾基體也有腫脹; 21d 神經元水腫, 游離核糖體減少, 溶酶體增多; 在紋狀體則有髓鞘松解斷裂, 突觸小泡多為清亮型, 顆粒小泡極少甚至看不見。

2. 3 　相關分析結果　旋轉行為與黑質DA 能神經元毀損比例呈正相關 ( r = 0. 471, P < 0. 01) ; 探究行為、穿梭距離、下肢站立行為均與毀損比例呈負相關 ( r = - 0. 719 、 - 0. 594 、 - 0. 589, P < 0. 01 ) ; 修飾行為與毀損比例無相關性( r= - 0. 227, P > 0. 05) 。

　　3　討　論

DA 作為內源性神經遞質作用于基底核 ( basalgang lia) 的 D 1 、 D 2 受體, 平衡調節基底核為中心的直接和間接神經回路功能。基底核并不發布對肌肉收縮的命令, 而是通過選擇不同的神經元發放電活動,參與隨意運動的程序編制和運動程序的執行, 在調節運動的組成、方向、順序、速度和幅度等方面發揮其作用。 PD 由于 SN c 區DA 能神經元退變, 導致紋狀體DA 含量下降, DA 對間接回路的去抑制和對直接回路的興奮兩種功能嚴重喪失, 導致運動障礙。本實驗的結果也顯示, 實驗組大鼠在毀損術后 1d 即有明顯行為學改變, 其中旋轉、探究、后肢站立和穿梭行為與黑質 DA 能神經元丟失比例有很好的相關性,而正常對照組和實驗對照組大鼠的行為在實驗前后沒有明顯改變。腦內DA 神經系統具有一定的代償功能, 如 PD患者在出現臨床癥狀時 SN c 區DA 能神經元丟失已達80% 以上, PD 模型大鼠由于 DA 受體超敏出現 DA激動劑誘導的旋轉運動等。在我們的行為學實驗中也觀察到這種代償現象, 開野實驗的旋轉、探究、后肢站立和穿梭行為指標在術后 3d 、 5d 有趨于改善的

傾向, 其可能機制: ( 1) DA 更新率增加, 殘存的DA 能神經元合成和釋放DA 的能力增強; ( 2)DA 受體超敏, 包括受體敏感性增強和受體數目的增加;( 3) 信號轉導效率的增強, 如 Gs 蛋白上調, A C 酶活力提高, 細胞外信號調節蛋白激酶 ( ex tracellu larsignal2regu lated k inase, ER K ) 的活化等。我們的實驗未發現修飾行為與黑質毀損比例有相關性, 但Ber r idge大鼠曠場實驗與黑質多巴胺能神經元的相關性研究

指出紋狀體在修飾行為的整合中起重要作用, 如果毀損雙側紋狀體前外側部, 則將打破修飾行為鏈。因此, 我們認為毀損一側SN c 區只能導致一側紋狀體 DA 含量下降, 而健側紋狀體足以發揮代償作用, 保持修飾行為鏈的完整性。另外, 可能與環境變化、手術損傷、麻醉等外界因素和觀察時間不夠也有一定的關系。6-O HDA 即 2. 4. 52 三羥基苯乙胺, 是一種選擇性兒茶酚胺能神經元化學毀損劑, 單獨或聯合注射到大鼠 SN c 、內側前腦束 ( M FB ) 、紋狀體 (Cp u ) 、腹側被蓋區 ( V TA ) 等不同腦區, 選擇性地毀損DA 和N E能神經元 ( 尤其對前者作用更顯著) 制作不同程度損害的PD 模型。其作用機制是: 6-O HDA 通過多巴胺轉運體進入 DA 能神經元, 快速氧化生成氧自由基( O 2-和·O H ) , 抑制線粒體氧化呼吸鏈復合物É , 并激活 casp ase 啟動細胞凋亡, 從而導致黑質DA 能神經元丟失。在我們的實驗中, 6-O HDA SN c 區注射后24h 即有50% 以上的DA 能神經元丟失, 而后隨時間推移毀損比例不斷增大。**組化切片經N issl復染發現, 非 DA 能神經元形態完整, 數量并不減少,在早期甚至有增多現象, 這說明 6-O HDA 是一種實用可靠的特異性 DA 能神經毒劑。但該法制作的模型仍屬于急性損傷完全毀損模型, DA 神經元在注藥后4h 即可見丟失。若用**誘導旋轉實驗作為鑒定標準, 一般為術后 2 ～ 3 周陽性, DA 神經系統毀損已相當嚴重, 不利于觀察輕中度毀損模型。許多研究指出, 對輕中度毀損模型的研究更有助于對臨床 PD 早期患者病理形態、神經生化和輕度行為異常的了解,有 助于 PD 病因、發病機制和**、細胞移植及基因**的研究。因此, 建立一個敏感反映輕中度毀損的行為學觀測指標, 具有較大的現實意義。我們利用開野實驗對毀損早期的大鼠進行行為學的觀察, 發現術后 1d 各項指標即已發生明顯改變, 并能很好地動態反映 DA 毀損程度。開野實驗不僅適用于輕中度毀損模型的觀測, 還能反映毀損早期機體的代償情況,并且各參數間可相互佐證, *大程度地減少主觀因素的影響。因此, 我們認為開野實驗是一個很好的反映DA 神經系統毀損程度的行為學觀察指標。大鼠曠場實驗與黑質多巴胺能神經元的相關性研究。