一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

（1）本實(shí)驗(yàn)通過進(jìn)行穿梭，跳臺，避暗，高架十字迷宮，曠場，懸尾，強(qiáng)迫游泳等實(shí)驗(yàn)來研究松樹皮提取物在改善學(xué)習(xí)記憶，抗焦慮，抗抑郁等方面的功效。

（2）研究松樹皮提取物對小鼠行為學(xué)方面的影響，為松樹皮提取物的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)實(shí)驗(yàn)材料。

二、實(shí)驗(yàn)材料 

動(dòng)物：  ICR 小鼠40只，重量( 20±2) g

     儀器：  小鼠行為學(xué)儀器（穿梭儀，避暗儀，高架十字迷宮（型號XR-XG201），懸尾強(qiáng)迫實(shí)驗(yàn)裝置等），儀器品牌：Xmaze。

三、實(shí)驗(yàn)方法

    3.1松樹皮提取物對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

3.1.1穿梭實(shí)驗(yàn)

取40只健康小鼠，雌雄各半，隨機(jī)分為4組，即空白對照組，松樹皮高，中，低劑量組，每組10只，分別灌胃給藥，空白對照組灌胃給與生理鹽水。連續(xù)給藥15天，與第11天開始穿梭實(shí)驗(yàn)。穿梭箱為一封閉的長方形盒子30cm×10cm×20cm，頂部有蜂鳴器 ，底部平行排列銅柵 ，間隔 0.5cm，銅柵可以通電。設(shè)定電刺激(1mA)時(shí)間15s ，蜂鳴 5s ，間隔 15s。訓(xùn)練時(shí)先將小鼠放入穿梭箱適應(yīng) 3min，然后給予電刺激 ，小鼠受到電刺激后逃到另一端 ，蜂鳴及電刺激立即停止。每日訓(xùn)練1次 ，每次20個(gè)循環(huán) ，共訓(xùn)練4天。第15天測驗(yàn)時(shí)，將小鼠放入穿梭箱一端，給予蜂鳴 5s ，然后通電 (1mA) ，間隔15s ，每次20個(gè)循環(huán)。記錄小鼠電刺激成功逃避次數(shù)，逃避反應(yīng)平均時(shí)間。

3.1.2 避暗實(shí)驗(yàn)  松樹皮提取物對小鼠行為學(xué)的影響

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物休息兩天但保持連續(xù)給藥，于16次給藥后1h進(jìn)行避暗實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)裝置分為明暗兩室，兩室之間有一直徑為3 cm的圓洞，暗室底部銅柵通電。訓(xùn)練時(shí)先將小鼠放入反應(yīng)箱中適應(yīng)5 min，然后暗室底部銅柵通以40 V、50 Hz 交流電，將小鼠背對洞口放入明室，小鼠進(jìn)入暗室即受電擊，記錄5 min內(nèi)進(jìn)入次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為訓(xùn)練成績。第17天給藥后再次將小鼠放入明室，記錄潛伏期和5 min內(nèi)進(jìn)入次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。 如果5 min時(shí)小鼠仍未進(jìn)入暗室，錯(cuò)誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為300 s。(訓(xùn)練時(shí)第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間(潛伏期)大于180 s者棄去不用)

3.2松樹皮提取物對小鼠焦慮行為的影響

3.2.1 高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)

        以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物休息兩天但保持連續(xù)給藥，于第21次給藥后1小時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。小鼠高架十字迷宮由 2 個(gè)開臂（長×寬：30cm×5 cm）和 2個(gè)閉臂（長×寬×高：30 cm×5 cm×15 cm） 組成，1個(gè)連接4只臂的中央平臺（5 cm×5 cm），開放臂與封閉臂二者互相垂直成十字狀。在迷宮正上方安裝好攝像機(jī)，調(diào)整好影像畫面，將4臂與中央平臺劃分為5個(gè)區(qū)域。將小鼠置于十字迷宮的中央平臺，使其頭部正對其中一個(gè)開放臂，開始計(jì)時(shí)，用動(dòng)物行為活動(dòng)記錄分析系統(tǒng)記錄并分析小鼠在迷宮內(nèi) 5 min 的探究行為，包括小鼠進(jìn)入 2 個(gè)閉臂的次數(shù)，進(jìn)入2個(gè)開臂的次數(shù)，在開臂的活動(dòng)時(shí)間，進(jìn)入開臂次數(shù)的百分比等。每實(shí)驗(yàn)完1只小鼠，用75％酒精擦洗迷宮并揮干，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。

3.2.2 曠場實(shí)驗(yàn)

         以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物休息兩天但保持連續(xù)給藥，于24次給藥后1小時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。曠場箱是一個(gè)單邊長為 27.5 cm、 總邊長為110 cm的正方形，在圖形上將該正方形區(qū)分為周邊、中央兩個(gè)區(qū)域。中央?yún)^(qū)為套在大正方形中的一個(gè)單邊長為13.75 cm、總邊長為55 cm的小正方形，此小正方形到大正方形各邊的距離相等。小正方形與大正方形之間的區(qū)域即為周邊區(qū)。在曠場箱正上方安裝好攝像機(jī)，調(diào)整好影像畫面。將小鼠置于曠場箱的中央，開始計(jì)時(shí)，用動(dòng)物行為活動(dòng)記錄分析系統(tǒng)記錄并分析小鼠在曠場箱內(nèi) 5 min 的自主探究行為，包括小鼠進(jìn)入中央格的次數(shù)，在中央格的活動(dòng)時(shí)間，進(jìn)入外周格的次數(shù)，在外周格的活動(dòng)時(shí)間等。每實(shí)驗(yàn)完1只小鼠，用75％酒精擦洗曠場箱并揮干，再進(jìn)行下一只小鼠的實(shí)驗(yàn)。

3.3松樹皮提取物對小鼠抑郁行為的影響

3.3.1 懸尾實(shí)驗(yàn)

       以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物休息兩天但保持連續(xù)給藥，于第26次給藥1 h 后進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)，距小鼠尾尖部約1 cm 處用橡皮膏貼于絲線的一端，將之固定于水平放置的棒狀物上，中間用板隔開，防止彼此看到對方，小鼠頭部離臺面約5 cm，室溫18 ℃保持恒定，小鼠懸掛2 min 后，立即開始觀察，觀察持續(xù)4 min，記錄4 min 內(nèi)小鼠的不動(dòng)( 小鼠在空中停止掙扎，或僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng)) 時(shí)間。

3.3.2強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，動(dòng)物休息兩天但保持連續(xù)給藥，于第28次給藥1 h 后，將小鼠放入高20 cm、直徑14 cm的圓柱型玻璃缸中，每缸1只，缸中水深10 cm，水溫( 25±1) ℃。小鼠游泳2 min 后， 立即開始觀察，觀察持續(xù)4 min， 記錄4 min 內(nèi)的小鼠不動(dòng)的時(shí)間( 小鼠在水中停止掙扎， 或動(dòng)物呈漂浮狀態(tài)，僅有細(xì)小的肢體運(yùn)動(dòng))。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1松樹皮提取物對小鼠學(xué)習(xí)記憶的影    松樹皮提取物對小鼠行為學(xué)的影響

結(jié)果見下表：

表4.1.1 松樹皮提取物對小鼠穿梭實(shí)驗(yàn)的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

表4.1.2 松樹皮提取物對小鼠避暗實(shí)驗(yàn)的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

從以上數(shù)據(jù)可以看出，**組和空白組在穿梭試驗(yàn)和避暗實(shí)驗(yàn)中的檢測指標(biāo)均未出現(xiàn)顯著性差異，這表明松樹皮提取物可能對小鼠的學(xué)習(xí)記憶行為影響不大。

4.2松樹皮提取物對小鼠焦慮行為的影響

結(jié)果見下表

表4.2.1 松樹皮提取物對高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

表4.2.2 松樹皮提取物對小鼠曠場實(shí)驗(yàn)的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

在高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，松樹皮提取物中劑量組在開臂停留時(shí)間百分率要明顯高于空白對照組，且有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但在曠場實(shí)驗(yàn)中，在中央格的次數(shù)并未增加，所以松樹皮提取物對小鼠的焦慮行為影響，可能需要進(jìn)行更加精密的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

結(jié)果見下表

表4.3 松樹皮提取物對小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的影響（土SD, n=10）

注：*與對照組比，p<0.05

從上表可以看出，在懸尾實(shí)驗(yàn)中，松樹皮提取物低劑量能顯著降低小鼠的不動(dòng)時(shí)間，提示可能有抗焦慮作用。但在強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)中，雖然松樹皮提取物低劑量組不動(dòng)時(shí)間減少，但并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是個(gè)體差異造成。這提示我們設(shè)計(jì)更加精密的抗抑郁實(shí)驗(yàn)?zāi)芨玫臋z測其作用。

五、實(shí)驗(yàn)討論

      穿梭和避暗實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛟u價(jià)動(dòng)物主動(dòng)回避和被動(dòng)回避外界環(huán)境刺激的能力。高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)，利用動(dòng)物對新異環(huán)境的恐懼心理和探究特性形成的矛盾沖突來考察動(dòng)物的焦慮水平。懸尾實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃蛷?qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ筒粍?dòng)時(shí)間是衡量動(dòng)物行為改變的主要指標(biāo)，既能反映造模成功與否，又可作為絕望動(dòng)物行為的指標(biāo)。以上實(shí)驗(yàn)在成功造模的基礎(chǔ)上可以很好的探究**對學(xué)習(xí)記憶，焦慮，抑郁行為的影響。

      高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)中，將動(dòng)物置于迷宮的中央?yún)^(qū)，在一定時(shí)間內(nèi)觀察動(dòng)物分別進(jìn)入開臂和閉臂的時(shí)間與次數(shù)。由于開臂和外界相通，動(dòng)物在好奇探究的同時(shí)也會產(chǎn)生焦慮反應(yīng)。若焦慮水平高，則動(dòng)物會離開開臂，反之則在開臂停留的時(shí)間長，對開臂的探究次數(shù)也增多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示松樹皮提取物中劑量組在開臂的停留時(shí)間明顯延長，提示可能有抗焦慮的作用。懸尾實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物的抑郁程度高，則不動(dòng)時(shí)間長，不動(dòng)時(shí)間短，活動(dòng)時(shí)間長，則說說明抑郁程度低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，松樹皮提取物低劑量組，懸尾實(shí)驗(yàn)中不動(dòng)時(shí)間明顯低于空白對照組，提示松樹皮提取物可能有抗抑郁的作用。

      本實(shí)驗(yàn)只是初步探究實(shí)驗(yàn)，得出的結(jié)果是為以后更加精密的實(shí)驗(yàn)做鋪墊。