運動影響學習與記憶能力動物實驗的研究進展
摘 要： 生理心理學的主要研究途徑和方法是通過建立相關動物模型，施加一定的影響因素，運用特殊的測量方法和指標，對實驗動物的整體水平或局部器官和組織進行研究。動物實驗可以克服人體實驗諸多的局限，達到理想的效果。伴隨著運動生物科學的不斷發展，運動與學習記憶動物模型的制作、反映指標的測定會不斷的改進，將在阿爾茨海默病及腦健康相關問題的防治過程中發揮重要的作用。
關鍵詞： 學習記憶；動物模型；運動方式；迷宮
阿爾茨海默病（又稱老年癡呆），是一種以進行性認知功能障礙和記憶損害為特征的**。隨著社會人口的老齡化，阿爾茨海默病的發病率逐年上升，已成為世界范圍的、越來越引起人們重視的健康問題。它不僅影響患者的生存質量，而且給家庭和社會帶來了沉重的負擔。據相關文獻顯示，適宜的運動可以對老年癡呆或缺血性腦梗死患者在改善認知、記憶、行為能力方面獲得明顯的療效。關于運動與學習記憶的研究，過去由于受實驗方法和檢測手段的限制，只是在腦神經生化標志物及其他行為等無創性指標方面較多。20 世紀后期，隨著動物實驗的開展以及腦分子生物學、生物化學、多種迷宮方法的應用，運動與學習記憶的研究進入了一個嶄新的階段。
1 運動影響學習與記憶研究中的動物模型
建立理想的學習記憶實驗動物模型，是開展運動與學習記憶研究工作的基礎。動物模型的制備應盡量模擬臨床致病因素，以期在發病機理、運動干預等方面獲得科學的數據。
1.1 老年癡呆（AD）模型
理想的AD動物模型應具有與老年性癡呆相似的基本特征：一、模型動物具有AD的主要神經病理學特征老年斑（SP）和神經元纖維纏結（NFT）；二、出現AD的重要病理變化如大腦神經元死亡、突觸丟失和反應性膠質細胞增生等；三、行為學上出現認知和記憶功能障礙。
AD動物模型的研究經過幾十年的努力取得了很大進展,目前大致可概括為：一、自然衰老模型：SAMPs鼠由日本京都大學竹田俊男教授開發成功，主要以學習記憶功能增齡性加速衰退，**神經系統如皮質、海馬等部位發生病理改變為主，是一種比較理想的研究腦老化和癡呆的模型。二、損害模型：Nelson等將D—半乳糖注入大鼠側腦室，6周后**組化分析可見NFT樣磷酸化和Aβ淀粉樣沉積斑塊，引起記憶嚴重缺失。H等利用小鼠腦室內注射AlCl3、長期腹腔內連續注射或口服鋁溶液獲得NFT病理改變的動物模型等等。三、轉基因動物模型：通過轉基因技術將AD的APP變異基因植入鼠，其腦能產生β淀粉樣蛋白沉積、神經炎性老年斑、突觸減少、星形細胞和小膠質增生、神經元退化及神經元程序性壞死等AD癥狀。
但每一種模型都只是在一定程度或某些方面模擬了AD的癥狀和病理改變，它們各有優勢和不足，應根據不同的實驗目的選擇合適的模型。總體趨勢從單因素的損傷模型到復合損傷模型，從單轉基因模型到雙轉甚至三轉基因模型，但仍存在諸多問題，如造價昂貴等，目前國內多數實驗室都選擇代價較少的復合損傷AD動物模型。隨著對AD發病的細胞分子機制認識的不斷深入,新的更完善的動物模型將會出現， 進一步促進對AD發病機制的了解和推動防治研究的進步。運動影響學習與記憶能力動物實驗的研究進展
1.2 血管型癡呆（VD)模型
VD*主要的致病因素是腦血管缺血，其動物模型的制作有血管阻斷法、栓塞法、大腦中動脈梗死法、光化學法、去大腦皮層法、腦血管定位阻斷法以及自發VD模型等，如：國內常通過光化學法誘導的雙側海馬梗死模型觀察大鼠雙側海馬梗死后訓練對學習記憶功能的影響。國外是參照小泉線栓法制成右側大腦動脈缺血梗死模型大鼠，表現為提尾時左側前肢內收屈曲，同側Horner氏征，爬行時向左劃圈，站立時左側傾倒。VD是一種多因素**，其發**展是多種致病因素、多個病理環節相互作用和累積的結果。而目前VD動物模型的制備都是從模擬人類VD發病的某一側面來完成的，與臨床實際還有一定的偏差。
1.3 基因（GD）模型
Shimizu等利用第3代基因敲除技術培育成海馬CA1區特定的NR1基因敲除小鼠來研究NMDAR在記憶鞏固階段的作用,NR1基因敲除后, CA1區NMDAR興奮性突觸后電位消失,無LTP的產生,并且在隱藏平臺水迷宮試驗中逃跑潛伏期明顯延長,說明海馬CA1區空間學習記憶需要NMDAR的參與[5]。Tang等利用轉基因技術,使NR2B 在轉基因小鼠的前腦過度表達,發現NMDAR通道開放時間延長,活性增強,這些轉基因小鼠在多種行為測試中表現出更好的學習和記憶能力[6]。
2 運動與學習記憶研究中動物的運動方式
2.1 游泳訓練
游泳是運動與學習記憶實驗中運動負荷的主要手段之一，通常把大鼠或小鼠作為游泳運動的研究對象，多采用靜水泳池。運動強度需要綜合考慮水溫、負重、時間等影響因素。
2.2 跑臺/跑輪運動
段氏動物跑臺主要是根據大鼠或小鼠跑步運動而設計的實驗裝置，目前應用較多，運動強度可通過調整跑的時間、跑速和跑臺坡度來準確控制，屬于被動運動。而跑輪是指動物在籠子中自主進行蹬爬，為主動運動。
2.3 滾筒式網狀訓練
滾筒式網狀訓練器為長100cm,直徑60cm的圓形網狀儀器,中間分為4個格,可同時訓練4只鼠,底座有一固定架,一端有一手搖柄,可手搖按5r/min進行轉動訓練，該器材可訓練大鼠的抓握、旋轉、行走等功能。
2.4 平衡木訓練
平衡木訓練采用長170cm,寬2cm的方木棒,平放在距地面7 cm處,作為一個平衡木讓鼠在其上行走,主要評估及訓練平衡功能。
2.5 網屏訓練
網屏為50cm ×40cm網帶,網眼為1cm ×1cm,網板的左右和上方都用25cm高的木板邊框,網屏距地面高度為80cm,先將網屏水平放置,將老鼠放在其上,然后緩緩地將其一端抬高,在2 s內將此屏變成垂直位,保持5s,觀察大白鼠是否會從網屏上掉下來或用前爪握住網屏,從而客觀地評價前爪抓握能力及肌力情況。
2.6轉棒訓練
轉棒疲勞儀訓練取長150 cm,直徑415cm的木棒一根,其中點固定在3r/min的轉動器上,分別向左右交替轉動，可評估及訓練動態的平衡功能。
3 運動影響學與記憶研究中行為學指標測定方法
3.1 迷宮
迷宮在實驗動物心理學形成及發展中的作用至關重要，從19世紀末20世紀初開始，迷宮已經成為心理學家測試動物能力常用的儀器。迷宮任務對實驗室測試特別適用，因為儀器本身可以告知動物需要它們做的是什么（類似于人類實驗的指示語）[7]。目前在學習記憶研究中*常用的有Morris水迷宮、Y迷宮、T迷宮以及4臂以上的放射臂迷宮等，涉及的被試動物主要是鼠。在迷宮實驗中通常采用的指標為：被試達到某一指定標準前所需要的學習次數；每輪實驗的錯誤次數和產生的位置；每輪實驗所需時間以及實驗中的行為表現。國內研究中應用*多的迷宮方法是Morris水迷宮和Y迷宮，作為考察辨別學習的工具，檢驗動物學習記憶特點及其腦機制以及運動對動物學習與記憶能力的影響等。
Morris 水迷宮是英國心理學家Morris于20世紀80年代初設計和使用的進行大鼠空間學習記憶研究的裝置，是較理想的測定動物空間學習記憶能力的行為實驗模型。Morris水迷宮為一圓形水池,直徑200cm,高50cm,水深30cm,水溫控制在22～24℃。池壁標明4個入水點,由此將水池分為4個象限,任選其中一個象限,正中放置一個直徑11cm、高29cm的平臺。包括：一、定位航行實驗：每天將實驗大鼠按東、南、西、北4個入水點依次放入水池中,同時記錄其在120s內尋找平臺的時間。二、空間探索實驗：將平臺撤走,進行大鼠120s內穿越原平臺位置的次數。運動影響學習與記憶能力動物實驗的研究進展
XR-XM101型morris水迷宮
Y迷宮為一個三等臂式迷宮，每臂頂端設一信號燈,信號燈亮后6s ,此臂即為危險區,通以36V 交流電,刺激大鼠從所在的亮臂跑到暗臂。訓練中始終有一臂為**區,**區按無規則的次序變換。如果大鼠在通電后從所在亮臂跑到另一亮臂記為錯誤,跑到暗臂則為正確。連續10 次測試中有9 次正確即為掌握迷宮結構,訓練次數越少表明大鼠學習能力越強，以此作為判斷大鼠學習分辨能力的指標 。
3.2 多功能反應箱
實驗方法:將多功能條件反應箱平放在60cm高的桌邊,跳板完全懸空,將小鼠尾對門洞平放在跳板上,小鼠能很快找到門洞并進入反應箱,這段時間記為電擊前步入潛伏期，關閉門洞,并用適宜電壓電擊前爪5～10s。如此反復3 次,24 h后重復測定小鼠在跳板上停留的潛伏期,記為電擊后步入潛伏期,*長觀察時間為300 s。凡達到300 s 仍不進入反應箱者,均視為記憶保持良好。
3.3 開場行為觀察
開場行為觀察也稱為曠場實驗，運動前、后將小鼠放入開場環境中，記錄小鼠1min內跑動的格數，3min內跑動的格數、后腿站立（包括扶壁站立和自由站立）次數、理毛次數、小便次數、大便粒數，用來觀察小鼠運動前后的反應。
4 運動影響學習與記憶研究中的評價指標
在腦功能定位分區中,海馬是研究動物和人類學習記憶、情緒、行為功能的經典腦區，而海馬神經的突觸可塑性則直接影響學習記憶功能。在腦科學的研究中，長時程增強 (LTP)效應被認為是神經突觸可塑性和突觸傳遞的一種表現形式 ，是學習記憶的神經細胞學基礎。因此凡是能影響海馬和LTP的指標均可以反映學習記憶能力。運動影響學習與記憶能力動物實驗的研究進展
4.1 與LTP間接相關的物質
4.1.1 細胞凋亡
學習與記憶是大腦主要的**神經功能之一,是由不同而又緊密聯系的神經元共同作用的結果。因此,保持神經元的健康和腦細胞的可塑性是學習和記憶的先決條件。已有研究報道,大鼠認知功能受損可能與海馬神經元的凋亡有關,腦細胞過早凋亡可引發腦萎縮、老年癡呆、帕金森氏癥等腦病,從而影響學習、記憶能力。Bcl-2、Bax是有關細胞凋亡的重要調控基因,Bcl-2又稱為“生存基因”,表達水平與細胞壽命呈正相關。而Bax為促凋亡基因,可使細胞器釋放出某些分子,引起半胱氨酸蛋白酶的活化,并拮抗Bcl-2的保護效應而使細胞趨于凋亡,或者通過啟動線粒體通透性轉變的方式誘導細胞凋亡。**（2008）實驗表明長期有規律的游泳運動可促使大鼠Bcl-2的表達增多, Bax的表達減少,抑制海馬細胞發生過早凋亡現象。
4.1.2 抗氧化物質
自由基具有強氧化性，可在體內氧化損傷許多器官和組織，進而引起慢性**及衰老效應。還可與細胞膜雙層結構中的不飽和脂肪酸反應產生過氧化脂質，后者經過分解生成丙二醛，丙二醛易與蛋白質或脂類聚合交聯作用形成脂褐素，因其不易被溶酶體消化,隨增齡而積累,所以被認為是細胞衰老的基本特征。大腦中脂褐素主要積聚在大腦皮層和海馬部位，學習記憶能力與大腦中脂褐素的含量呈負相關。金花等(1995)報道運動訓練使大鼠大腦皮層的脂褐素下降，其機制可能是適量的訓練通過降低脂質過氧化水平,減弱丙二醛交聯作用,從而減少脂褐素的生成,減慢在細胞中的積累,延緩老化過程。機體內抗氧化系統對減輕自由基增加而引起組織損傷也有重要作用，其中一種重要的抗氧化酶是超氧化物歧化酶（SOD）,它能催化生物氧化產生的O2- 轉化為H2O2 和O2+ ,以防止對細胞的損傷，Jenkins(1993年)報道有氧運動可提高SOD 活性。抗氧化系統中還有一種重要的抗氧化劑,還原型谷胱甘肽(GSH)，Kretzchmar(1990 年)報道訓練有素的長跑運動員血漿中GSH 濃度較一般人。這些均說明適度運動可增加腦組織抗氧化及抗衰老能力。
4.1.3 突觸可塑性
突觸可塑性包括突觸傳遞可塑性、發育可塑性和形態的可塑性。大腦皮層和海馬是學習記憶功能相關腦區，衰老時該區域突觸形態結構和數量發生變化，包括突觸密度減少、突觸界面曲率降低、間隙寬度加大、突觸后致密物質變薄、突觸膜的流動性降低以及突觸素含量減少等，均與學習記憶功能障礙密切相關 。突觸可塑性的變化還可能是阿爾茨海默病神經生物學基礎。任珊珊等（2010年）實驗研究表明9周的跑臺運動可逆轉衰老小鼠突觸數量衰減和突觸膜流動性下降，說明適量運動可以促進衰老化過程中大腦認知功能區突觸的可塑性代償，延緩老年癡呆的發生。運動影響學習與記憶能力動物實驗的研究進展
4.1.4 腦內神經遞質
卡爾森于1958年首先報道了腦內多巴胺（DA）的存在，并闡明了DA的信號傳遞功能以及它在人類控制運動中的作用；格林加德發現了多巴胺和其它相似遞質刺激神經細胞時的過程；坎德爾在格林加德理論的基礎上，通過海兔的縮鰓反射實驗證實，記憶功能就是由無數構成神經細胞間接觸點的突觸直接改變引起的，神經遞質DA通過**信使引起蛋白磷酸化，后者進入細胞核，啟動新蛋白質合成，從而使生物產生了短期和長期記憶，由此可見DA與學習記憶功能有密切的關系。徐波等（2004）實驗表明長期適宜的游泳訓練能增強大鼠腦內海馬、伏隔核和前額葉皮層中的DA，然后通過神經遞質的正相調控作用可提高大鼠的學習記憶能力。
4.2 與LTP直接相關的物質
4.2.1腦源性神經營養因子
BDNF是由德國神經生物學家Barde于1982年首先報道的，它主要在腦組織合成，廣泛分布于**神經系統，其中大腦皮質、海馬等部位含量較為豐富，不但對神經系統有營養作用，還與突觸功能和可塑性的調控有關。BDNF作用的主要受體是TrkB（trosine kinase B），通過配體受體結合，誘導神經元胞體上的Trk酪氨酸激酶形成二聚體和自磷酸化，從而激活胞內信號轉導通路發揮其功能作用。Jovanovic等報道BDNF能易化與學習記憶過程聯系密切的神經遞質谷氨酸的釋放，這是通過BDNF/TrkB/MAPK信號級聯反應對突觸蛋白的磷酸化水平進行調控而實現的。Xiong等報道BDNF可調節**神經系統NO的合成，有助于NO所介導的學習記憶過程。Lin的研究顯示BDNF能磷酸化海馬CA1區突觸后NMDA受體的NR1和NR2，產生LTP，提高學習與記憶功能。Neeper等的實驗發現一周的自愿轉輪運動即可顯著增加大鼠海馬和新皮層BDNFmRNA的水平，進而通過介導細胞內多種信號轉導通路對學習記憶起促進作用。
4.2.2 胰島素樣生長因子—1
lGF—1是Sallmon和Daugha—day于1957年首先報道的。IGF-1及其受體廣泛存在于腦中，特別是海馬組織，能促進神經細胞生長、分化和增值，減少局部缺氧缺血造成的腦神經元損傷，刺激膠質細胞分化，刺激DNA合成和軸突生長，調節海馬乙酰膽堿的釋放，調節海馬突觸的可塑性，并有抗凋亡作用。另外，IGF-1與年齡相關的神經退行性**的發病機制有關，如阿爾茨海默病。在運動誘導下，海馬內IGF-1水平升高，海馬內的IGF—l和BDNF通過其受體激活p-CAMKlI和p-MAPK II信號級聯，進而增加突觸素一1，突觸素一1又可以促進Glu釋放，增強突觸間的信息傳遞，使長時程記憶增強，故運動促進IGF-1的表達可能是運動促進學習記憶的機制之一。
4.2.3 MAPK/ERK
MAPK/ERK信號轉導通路是多種細胞外信號從細胞表面傳導到細胞內的重要傳遞者，絲裂素活化蛋白激酶（MAPK）是細胞內的一類絲氨/蘇氨酸蛋白激酶，細胞外信號調節激酶（EPK），是MAPK家族中的重要成員。ERK被激活后發生核轉位可直接激活轉錄因子Elk—1，啟動即早基因的轉錄；ERK也可通過激活核糖體S6激酶（Rsk）來激活轉錄因子cAMP效應元件結合蛋白(CREB), 長期記憶的形成需要啟動基因的表達。同時在海馬CA1區活化的ERK可使組蛋白H3的乙酰化增加，組蛋白是染色質的主要組成成分，而DNA被緊密地包裹在染色質中，從而有助于基因的表達。Shen報道適宜的運動，使 MAPK / ERK信號通路磷酸化水平提高，通過誘導BDNF和其他神經營養因子等靶基因的表達，提高學習記憶功能。
4.2.4 CREB
80年代后期，Montrminy MRL和Yamamoto KK在研究基因轉錄的調節時，先后通過親和層析的方法，從PEI2細胞系的核抽提物和大鼠腦組織中，分離純化得到環磷酸腺苷反應元件結合蛋白（CREB），其作為一種核轉錄因子，在學習記憶中有著重要作用，長期記憶的形成不但需要新蛋白質合成，而且也需要新基因的轉錄，來自對海兔、果蠅、小鼠以及大鼠的大量研究表明，磷酸化后的CREB是海馬區基因轉錄的開關，它引發的基因表達可加強海馬區長時程記憶的形成。AndersonBJ研究表明經過對大鼠7周的主動訓練，可以引起**神經系統內cAMP、Ca2+等**信使增加，使CREB參與記憶的形成。從細胞信號轉導的角度來看，不同通路在*后共同作用于CREB，通過影響CREB的磷酸化來激活c—fos、BDNF等多種與記憶有關的靶基因轉錄，*終導致學習記憶能力的提高。
4.2.5 GLU/NMDA
谷氨酸是**神經系統*主要的興奮性遞質，通過激活谷氨酸受體介導快速的興奮性突觸傳遞，與學習記憶過程有密切關系。其中谷氨酸離子型受體NMDA(N—甲基—D—天門冬氨酸)是非常重要的突觸后成分，不僅可誘導出興奮依賴性的突觸可塑性，而且在細胞間的信息傳導中也發揮著重要作用。LTP的形成和維持都需要NMDA受體的參與，因此NMDA受體被認為是突觸可塑性及皮質和海馬神經元長時程增強效應的主要調控者，構成了**神經系統的重要功能和學習記憶的分子基礎，其主要由NR1和NR2兩種亞基構成。張輝等（2007）報道適宜的運動訓練，如滾筒式網狀訓練、平衡木訓練等，可以促進NR1和NR2表達，進而NMDA密度增加，LTP產生增多，突觸的傳遞效率提高，有利于學習記憶能力的增強。運動影響學習與記憶能力動物實驗的研究進展
4.2.6 NO/NOS
海馬NO主要來源于神經元的NOS（一氧化氮合酶），現已明確NO作為逆行遞質參與LTP的形成，其機制是：突觸后NMDA受體及非NMDA受體激活，Ca2+內流，與鈣調蛋白一起活化NOS，催化產生NO；NO可自由而迅速地透過細胞膜，進入突觸前成份，激活可溶型鳥苷酸環化酶(sGc)，并使sGC活化后引起細胞內cGMP水平升高，進一步促進谷氨酸合成及遞質釋放；谷氨酸再作用于突觸后NMDA及非NMDA受體而實現對LTP的誘導。孫國欣等（2006）報道中等強度運動可以使大鼠海馬CA1區NOS及其亞型表達升高，NO生成量增多，從而改善了學習記憶能力。而劉鴻宇等（2006）報道大強度訓練刺激海馬N0/N 0S過度表達，過量的NO在**神經系統中又有毒性作用,影響學習記憶。
4.2.7 C-FOS
c—fos和c—jun屬于即早刻基因家族，與學習記憶有關。當其被快速誘導轉錄時，胞漿中的mRNA數量迅速增加，翻譯出的Fos和Jun進入細胞核內并形成異源二聚體Fos—Jun復合物，該復合物結合到靶基因的調節區,成為TPA反應元件(TRE)的7bp增強子單元，從而進一步影響靶基因的表達。已發現許多與記憶密切相關的基因，如膠原酶、神經生長因子和珠蛋白啟動子中都有TRE區，Fos—Jun復合物即可結合到這些基因的TRE區，誘導其表達，因而，c—fos基因通過影響轉錄和翻譯控制進而影響學習記憶功能。楊毅飛等（2005）報道長期適宜的運動訓練可以引起**神經系統內cAMP、ca2+等**信使適量增加，從而誘導c—fos基因表達，控制下游靶基因的轉錄，從而合成新的蛋白質，因此，有利于大腦的記憶功能，這將為運動促進學習記憶在分子水平上提供一個有力的證據。
4.2.8 CaM/CaMK
長時程增強LTP是以突觸后致密結構(PSD)為基礎的，Ca2+／CaM依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)是一種鈣依賴性蛋白激酶，約占PSD蛋白總量的30％一50％，在突觸部位起記憶的分子開關作用。CaMKⅡ自身磷酸化后變成不依賴Ca2+的活化狀態，活化的CaMKⅡ對學習記憶有以下作用：
（1）活化的CaMKⅡ移向谷氨酸受體，對受體進行磷酸化，從而進一步活化谷氨酸受體。
（2）活化的CaMKⅡ磷酸化離子通道，從而改變神經元的興奮性。
（3）活化的CaMKⅡ磷酸化中間纖維，改變了神經元的形態、突觸的數量及結構。孫臣友等報道游泳訓練使位于NMDA受體通道內阻止ca2+內流的Mg2+移開，這樣通道打開，ca2+內流，繼而激活ca2+／CaM**信使，Ca2+／CaM激活CaMKⅡ的基因表達，從而通過CaMKⅡ的自身磷酸化使谷氨酸受體的亞基磷酸化增加，保證了突觸信號傳遞的有效進行，使學習記憶能力得到提高。
以上指標從不同角度反映運動引起模型動物學習記憶的變化以及程度，但這些指標均有局限性，需要綜合多種信息才能準確判斷。
