Morris水迷宮檢測的記憶屬性與方法學(xué)初探隨著學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的不斷深入以及尋找有效防治認(rèn)知障礙類**方法的需要，客觀準(zhǔn)確地評價實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶水平已經(jīng)成為神經(jīng)生物學(xué)和神經(jīng)藥理學(xué)中非常重要的研究內(nèi)容。我們在研究老年性癡呆的過程中，認(rèn)為Morris水迷宮可作為檢測實(shí)驗(yàn)動物學(xué)習(xí)記憶水平的重要工具。為此，我們想就Morris水迷宮所檢測的記憶屬性和有關(guān)的方法學(xué)問題作一初步的探討。
1 Morris水迷宮檢測程序和記憶屬性
學(xué)習(xí)記憶是腦的**神經(jīng)生理活動。學(xué)習(xí)是指接受外界環(huán)境信息而影響自身行為的過程，記憶則是指獲得的信息或經(jīng)驗(yàn)在腦內(nèi)儲存、加工和提取的過程。學(xué)習(xí)記憶既是認(rèn)知活動中的重要方面，也是智力結(jié)構(gòu)中的重要要素。近年來，隨著學(xué)習(xí)記憶本質(zhì)內(nèi)容研究的不斷深入，特別是“層次性多重記憶系統(tǒng)”理論的建立［1，2］，徹底地改變了學(xué)習(xí)記憶的研究進(jìn)程和研究方向。也使得過去對記憶的分類有了更深刻的內(nèi)涵。例如瞬時記憶、短時記憶和長時記憶，外顯性記憶和內(nèi)隱性記憶(或程序性記憶和陳述性記憶)等的劃分，不再僅僅是學(xué)習(xí)記憶表現(xiàn)形式上的不同，而且更重要的是它們可能分屬不同的記憶系統(tǒng)，存在著不同的信息加工和提取方式，涉及不同的神經(jīng)機(jī)制。只有在討論某一特定記憶系統(tǒng)中某一具體學(xué)習(xí)記憶過程時，研究它的機(jī)制才有意義。
Morris水迷宮是英國心理學(xué)家Morris于20世紀(jì)80年代初設(shè)計并應(yīng)用于學(xué)習(xí)記憶腦機(jī)制研究的［3］。它包括一個盛有水的圓形水池、隱藏在水面下的平臺以及一套圖象自動采集和處理系統(tǒng)(攝像機(jī)、錄像機(jī)、顯示器和分析軟件等)。此后，該迷宮系統(tǒng)被廣泛運(yùn)用在神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究中，實(shí)驗(yàn)動物主要是大鼠。較為經(jīng)典的Morris水迷宮測試程序主要包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)兩個部分。其中定位航行試驗(yàn)(placenavigation)歷時數(shù)天，每天將大鼠面向池壁分別從4個入水點(diǎn)放入水中若干次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期，escapelatency)。空間探索試驗(yàn)(spatialprobe)是在定位航行試驗(yàn)后去除平臺，然后任選一個入水點(diǎn)將大鼠放入水池中，記錄其在一定時間內(nèi)的游泳軌跡，考察大鼠對原平臺的記憶。實(shí)驗(yàn)可供分析的參數(shù)較多，包括逃避潛伏期、各象限游泳距離、原平臺象限游泳距離與總距離之比、原平臺象限游泳時間與總時間之比、平臺偏離角、40cm穿環(huán)時間、跨平臺次數(shù)以及中、外環(huán)游泳距離百分比等。
經(jīng)典的Morris水迷宮所檢測的是大鼠在多次的訓(xùn)練中，學(xué)會尋找固定位置的隱蔽平臺，形成穩(wěn)定的空間位置認(rèn)知，這種空間認(rèn)知是加工空間信息(外部線索)形成的。平臺的位置與大鼠自身所處的位置和狀態(tài)無關(guān)，是一種以異我為參照點(diǎn)的參考認(rèn)知(allocentriccognition)，所形成的記憶是一種空間參考記憶(referencememory)。從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶進(jìn)入意識系統(tǒng)，其儲存的機(jī)制主要涉及邊緣系統(tǒng)(如海馬)以及大腦皮層有關(guān)腦區(qū)，常伴有Hebb突觸修飾［3，4］，應(yīng)該屬于陳述性記憶(declarativememory)。而臨床健忘和癡呆的病人，正是陳述性記憶首先受損而且比較突出［5］。所以從檢測的記憶屬性來說，運(yùn)用Morris水迷宮來進(jìn)行防治此類**有效**的篩選研究是比較恰當(dāng)?shù)摹?/span>
任何一種學(xué)習(xí)記憶的檢測工具所檢測的學(xué)習(xí)記憶類型，可以隨著檢測程序的變化而不同。Frick等對經(jīng)典的Morris水迷宮檢測程序進(jìn)行了完善［6］。他們在用固定位置平臺測試大鼠空間參考記憶之后，再將平臺的位置改為不固定，進(jìn)一步檢測大鼠的工作記憶(workingmemory)能力。顯然，尋找不固定平臺的認(rèn)知過程要復(fù)雜一些，需要大鼠對時間以及空間上分離的信息加以整合和判斷。Olton等設(shè)計的八等臂迷宮檢測程序中也提出了類似的概念［7］。值得注意的是，很多時候參考記憶和工作記憶的變化可以是不同步的。Frick的研究提示，大鼠在17月齡之后始出現(xiàn)參考記憶受損，大鼠的工作記憶則要在24月齡才較青年組有明顯改變［6］。我們的研究結(jié)果亦證實(shí)15月齡的大鼠參考記憶與青年大鼠比較并無明顯減退(如圖1)，青年組和15月齡初老年組多因素方差分析比較，差異無顯著性(P＞0.05)。
2 Morris水迷宮檢測方法與統(tǒng)計分析
所有Morris水迷宮的基本實(shí)驗(yàn)程序和方法都是相似的，方法上的不同可能對結(jié)果有重要影響的主要是在檢測時限和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析上，就此結(jié)合自己的實(shí)驗(yàn)結(jié)果談?wù)勎覀兊目捶ā?/span>
2.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求 在Morris水迷宮測試中，實(shí)驗(yàn)環(huán)境對結(jié)果影響較大的主要是迷宮周圍的物品甚至掛物所提供的空間線索必須保持固定不變，即認(rèn)知的“參照系”要一致。這里面*容易被忽視的是實(shí)驗(yàn)者在實(shí)驗(yàn)過程中所處的位置，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)者如果在實(shí)驗(yàn)動物視野之內(nèi)的話，也就自然成了實(shí)驗(yàn)動物所記憶的參照物之一。假如在實(shí)驗(yàn)過程中，實(shí)驗(yàn)者經(jīng)常變換位置或不停地走動，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果自然會有較大的影響。其次，在我們的實(shí)驗(yàn)中還觀察到，迷宮的水溫也是影響實(shí)驗(yàn)動物的“逃避動機(jī)”進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。大致上來說，水溫應(yīng)該略低，而且在實(shí)驗(yàn)期間應(yīng)盡量保持恒定。另外，在實(shí)驗(yàn)過程中保持安靜及光線的一致也是很重要的。除此之外，很多研究者還強(qiáng)調(diào)應(yīng)該在迷宮的水中加入牛奶等使之渾濁，以幫助隱藏水面下的平臺。但從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，不加入牛奶對實(shí)驗(yàn)結(jié)果并無影響，這可能與隱藏平臺低于水面1～2cm，而大鼠在游泳逃避時總是抬起頭部(避免水淹)有關(guān)。
2.2 檢測時間 Morris水迷宮測試的周期往往根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求來確定，一般為7～15d。目前的主要問題是在定位航行試驗(yàn)中允許實(shí)驗(yàn)動物尋找平臺的*大時限取多少(即*大潛伏期)合適。現(xiàn)在有的取120s，有的取180s，*近的文獻(xiàn)報告則以60s居多［6］。但究竟取多少合適，大都是實(shí)驗(yàn)者根據(jù)個人的經(jīng)驗(yàn)來確定，并無統(tǒng)計學(xué)的結(jié)果支持。據(jù)我們的初步統(tǒng)計結(jié)果顯示，大鼠在60～120s之間能夠找到隱藏平臺的次數(shù)差異大約只占其找到平臺總次數(shù)的5%，這在統(tǒng)計學(xué)上，可以看作是“小概率事件”。也就是說，大鼠在60s內(nèi)找不到隱藏平臺的話，再延長到120s也很難找到。從這一點(diǎn)考慮，似乎*大潛伏期取60s可以節(jié)約實(shí)驗(yàn)時間。但問題并非如此簡單，由于在統(tǒng)計時，很多研究將*大潛伏期直接納入統(tǒng)計，顯然，*大潛伏期的不同將不可避免地影響統(tǒng)計結(jié)果。所以從統(tǒng)計學(xué)上了解不同的*大潛伏期到底對Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果有多大的影響，如何避免因此帶來的系統(tǒng)誤差等問題尚有待進(jìn)一步研究。
圖1 不同組大鼠每天平均逃避潛伏期變化
2.3 統(tǒng)計分析 Morris水迷宮的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)較為復(fù)雜，其統(tǒng)計分析難度也較大，尤其是對大鼠在定位航行中所測得的逃避潛伏期如何進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析既往存在的問題較多。在過去的研究中，有的直接計算每天的平均逃避潛伏期后再進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析，或根據(jù)大鼠的逃避潛伏期在定位航行試驗(yàn)后3d趨于穩(wěn)定的情況，僅對后3d的平均逃避潛伏期進(jìn)行t檢驗(yàn)或方差分析。有的研究則就1～5d的逃避潛伏期進(jìn)行單因素方差分析。我們認(rèn)為以上統(tǒng)計方法均不正確。一個較明顯的錯誤是，以趨于平穩(wěn)的后3d的平均逃避潛伏期代表記憶水平，首先遇到的問題是僅在生理狀態(tài)下的大鼠才表現(xiàn)如此，而實(shí)驗(yàn)記憶損傷組大鼠往往后3d的逃避潛伏期仍然持續(xù)下降。如圖1所示，正常青年組和初老年組大鼠的逃避潛伏期在后3d趨于平穩(wěn)，但實(shí)驗(yàn)損傷組大鼠的逃避潛伏期由于學(xué)習(xí)記憶損傷后其基線較高，第3～5天逃避潛伏期仍然呈下降的趨勢，并不象正常對照組一樣趨于穩(wěn)定。不僅如此，還存在上述統(tǒng)計方法對定位航行試驗(yàn)中測得的逃避潛伏期數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)特征的認(rèn)識錯誤。定位航行試驗(yàn)中的逃避潛伏期具有以下特點(diǎn)：①系重復(fù)測量設(shè)計，即在給予某種處理后，在不同的時間點(diǎn)上從同一受試對象上重復(fù)測量獲得的數(shù)據(jù)(逃避潛伏期)；②影響逃避潛伏期(自變量)統(tǒng)計分析結(jié)果的至少有動物組別、檢測時點(diǎn)等多個效應(yīng)因子(effectivefactor)，效應(yīng)因子之間存在交互影響效應(yīng)；③同一受試動物的不同時間點(diǎn)所測得的逃避潛伏期存在高度的自相關(guān)性；④存在截尾數(shù)據(jù)(*大潛伏期)。據(jù)此，我們認(rèn)為對Morris水迷宮中定位航行試驗(yàn)的逃避潛伏期應(yīng)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析結(jié)合截尾數(shù)據(jù)的生存分析方法較為恰當(dāng)［8，9］。
3 Morris水迷宮的應(yīng)用和評價
目前，Morris水迷宮主要應(yīng)用在學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制探討和神經(jīng)藥理(包括中藥藥理)的研究。與過去的水迷宮及跳臺、避暗等檢測工具相比，其主要的優(yōu)點(diǎn)包括：能提供較多的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，系統(tǒng)**地考察實(shí)驗(yàn)動物空間認(rèn)知加工的過程，客觀地反映其認(rèn)知水平；將實(shí)驗(yàn)動物的學(xué)習(xí)記憶障礙和感覺、運(yùn)動缺陷等分離開來，減少它們對學(xué)習(xí)記憶過程檢測的干擾；操作簡便，數(shù)據(jù)誤差較小。不足之處是實(shí)驗(yàn)程序的設(shè)計需要考慮的因素較多，Morris水迷宮檢測的記憶屬性與方法學(xué)初探需要實(shí)驗(yàn)者具備一定的神經(jīng)生物學(xué)、認(rèn)知心理學(xué)和數(shù)理統(tǒng)計方面的知識；其次，統(tǒng)計分析較為復(fù)雜。
