Morris水迷宮實驗準則
內容概要
一、實驗原理（水迷宮的發展史，以及簡單的實驗原理和應用領域，以及在我國的發展情況和國內外的主要廠家）
二、Morris水迷宮的組成（主要分為硬件和圖像采集，軟件）
三、硬件準則（國內外文獻提及到的硬件準則，我們主要針對國內文獻提及到的）
四、實驗流程準則（實驗細節）
五、統計方法學準則（遵循統計學原理）
六、評價指標的準則（實驗數據的解釋）
七、實驗適用范圍準則（實驗適用四個領域，與水迷宮的10個優點）
上海欣軟信息科技有限公司
20世紀80年代初,英國的心理學家Morris和他的同事利用大鼠在盛有水和牛奶混合物的不透明水池中搜索目標物的方法,研究大鼠的海馬等腦區受到損害后的學習、記憶和空間定向以及認知能力時取得了令人矚目的結果。這種裝置不但構思新穎、實驗設計合理以及方法簡便和實用,而且便于觀察和記錄動物入水后搜索藏在水下平臺所需的時間、采用的策略和它們的游泳軌跡,從而可分析和推斷動物的學習、記憶和空間認知等方面的能力。雖然起初的實驗對象為大鼠，但此后該迷宮系統成為評估嚙齒類動物空間學習和記憶能力的經典程序，廣泛運用于神經生物學、藥理學等領域的基礎和應用研究中。它能較客觀地衡量動物空間記憶、工作記憶以及空間辨別能力的改變。因此,這種研究方法很快就引起各國神經科學家的關注,并將此法稱為Morris水迷宮法。國外有許多生產Morris水迷宮的公司，比如說德國的TSE公司，美國的ANY-maze公司等等；20世紀80年代末,中國科學院心理研究所建立了我國**個Morris水迷宮實驗室,并于90年代初建立了Morris水迷宮圖像自動采集和處理系統。國內隨后出現了許多Morris水迷宮生產廠家，比如說有上海欣軟、北京藥研所、上海移等等，但是從國際到國內，Morris水迷宮的硬件設備，軟件系統，實驗方法，以及實驗數據的處理方法都不盡相同，因此，從Morris水迷宮法的發明到現在已有20余年的歷史了，應該制定一套比較標準的實驗準則了。 Morris實驗系統由水迷宮裝置、水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統組成。morris水迷宮實驗準則 1、Morris水迷宮裝置:主要由盛水的水池和一個可調節高度和可移動位置的站臺所組成。
2、水迷宮圖像自動采集和軟件分析系統:該系統的主要部件為攝像機、計算機和圖像采集卡等。這種系統有多種型號,但工作原理和流程大致相似:攝像頭采集大鼠游泳圖像(模擬信號)輸入到計算機中的圖像采集卡進行模/數轉換,大鼠游泳的模擬圖像轉化為數字圖像儲存于硬盤中,將數字圖像進行圖像分析得到有關的測試參數。軟件分析系統能自動地采集動物的入水位置、游泳的速度、搜索目標等所需時間、運行軌跡和搜索策略等參數,并可將所采集的各種資料進行統計和分析。
1、 水池和站臺：對于水池的大小，存在一個人為選擇的問題，看起來應該統一標準，其實并不容易。但是有個原則就是水池不能太小，站臺也不能太大。Morris*初（1981年）用于大鼠的水池是直徑1.32米、高為0.6米，水池的水深為0.40米;但后來（1984年）改為直徑2.14米、高0.4米，水池的水深為0.25米。對于小鼠的實驗水池，文獻中介紹的迷宮直徑差異巨大，小到0.6米, 大到2.0米。一般而言，過小的水池使小鼠爬上平臺的偶然性增加，任務難度減小。過大的水池會使小鼠游泳路徑延長，體力消耗過大，爬上站臺的機率減少?，F在國內文獻中所用水迷宮水池大多數為大鼠1.6m或1.8m居多，而小鼠一般為1m或1.2m，高0.5m。站臺一般為圓形，直徑可分為大鼠12cm,小鼠6cm,表面粗糙，高度一般為30cm。國外文獻中所用水迷宮水池大多數為大鼠1.8m或2.0m居多，高0.6m,站臺直徑10cm；而小鼠一般為1m到1.5m，高0.3m站臺直徑5cm。2、 水溫：水的溫度要求實驗過程中恒溫。大鼠溫度范圍一般為25± 1℃，小鼠可能低些在18~22℃。有文獻報道，對小鼠進行了水溫對迷宮成績影響的觀察，結果發現27~28℃組的小鼠成績*差，而17~18℃組和21~22℃組小鼠的學習成績沒有區別，所以，我們推薦小鼠水迷宮的實驗用21~22℃水。水溫對潛伏期影響很大，特別是大鼠，如果溫度過高，大鼠在游幾次后漸漸適應了迷宮環境，它就會把迷宮當“浴盆”了，放進去以后，就漂浮不動；如果水溫過低，大鼠體溫下降很快，體力也會耗散太多，大鼠游泳能力不能堅持很久，就會出現游幾次潛伏期突然增大的現象。甚至有些老鼠會出現較明顯的應激反應，比如說會出現抽筋，腹瀉現象。水溫一般保持25度左右，另外氣溫也會導致水溫偏差過大，應人為的調節水溫。所以就要求在水池的底部裝有可以恒定保持水溫的加熱棒或者其他加熱裝置了。
3、 光源：要保證水池水面上沒有光影，主要是要避免光線在水面的反射問題，以免留在水面的光照影子被軟件的采集系統將光影和鼠的影子混淆；如果是白色的水池背景，就可以在水池上方用兩根條形的發散日光燈，這樣可以減少反射光在水面的背影；如果是黑色的水池背景，就在水池四個象限的上方放置4個60瓦的燈泡或25瓦的管燈，不用功率特別大的燈。燈泡的高度應該足夠高，不能被攝像頭捕獲到。另外還可以在水池四周裝一圈簾子（顏色一般是黑色、淺藍色或者白色），這樣可以將光的影子擋住，又保持一定的透光度。同時也可以減少外界的人站在水池旁邊某個地方或走來走去，對大鼠形成一個不定的空間參照物。
4、 空間線索（參照物）：水池應該置于一個較大的房間內，池壁上懸掛兩個以上物體作為近距離視覺參照物，并在水池外房間內有多種遠距離視覺參照物。比如幾何圖形（正方形、三角形、圓形等）懸掛于水池以外的墻上，高度是必須讓大小鼠在游泳的時候看的見的范圍，所以應該在其視平線以上，這些幾何圖形可以是寬5cm至15cm塑料板制成，高度是必須高過站臺,可以用1m的線掛在水池周圍；這些幾何圖形一般涂成黑色，因為嚙齒類動物對黑色比較敏感；這些幾何圖形一般不少于3個。另外實驗室環境是一個十分重要的因素,實驗室的設備、儀器、工作臺、椅子、門窗和燈具等陳設的位置和實驗人員進行實驗操作時所站立的位置都可能被大小鼠看見，如果移動會影響實驗結果。因為動物有時會常常利用實驗室內固有的環境作為它搜索目標時的參照物。
Morris水迷宮實驗主要測定空間學習記憶能力，主要的實驗內容有隱蔽站臺試驗、空間探索試驗、反向試驗和可視站臺試驗等。在這里主要介紹下文獻里面主要做的隱蔽站臺試驗和空間探索試驗的流程準則morris水迷宮實驗準則。
隱蔽站臺試驗：
嚙齒類動物**次游泳時,一般不會找到藏于水面下的不可見的站臺。若動物在入水游泳60～90s以內仍未能找到水池中的站臺或未能爬上站臺時,實驗人員可將動物引導置于站臺上站立10～30s,使動物體會站在站臺上的感覺,這樣從**次開始,學習成績就能迅速提高。動物爬上站臺后,讓動物在站臺上站立5～10s。將大鼠從站臺上拿下來,休息30～60s以后再進行下一次訓練。在一般情況下,正常大鼠在經過4～6個實驗日訓練后,很快就學會以*快*佳的軌跡搜索到站臺的確切位置。
每天開始時，將鼠任意從四個象限（東北、西北、東南、西南）之一面向池壁放入水中，站臺放置于東南象限，每次實驗鼠共游泳60～90s來尋找隱藏的站臺。如果成功地找到站臺，鼠可以得到在站臺上的10～30s休息時間；如果60～90s內未能成功的找到站臺，就由實驗人員將鼠人工置于站臺上，且同樣給予10～30s的休息時間。有時鼠可能會在10～30s間隔時間到達之前從站臺上掉下或跳入水中繼續游泳。一旦這種情況發生，則將鼠重新放回站臺，并重新計時，使時間間隔到達（10～30s）。這樣可以確保每只鼠在每次實驗后有相等的時間來觀察和獲取空間信息。
空間探索試驗：
隱蔽站臺試驗結束24h后，撤除站臺。然后任選一相同入水點將鼠放入水中，記錄鼠在60s或120s內的游泳路徑，記錄鼠在原站臺象限的停留時間和穿越原站臺次數，觀察受試鼠的空間定位能力，及在空間探索過程中的變化規律。在電腦屏幕上用圓形環標記出站臺原所在位置，這樣可以記錄穿越原站臺所在位置的次數。
實驗流程準則：
1、 實驗時間：隱蔽站臺試驗一般設計天數為4天或者6天，如果是年老體弱鼠可以將天數設計為4天。訓練時間一般為60s或90s,也有用120s的，不過現在一般都改用60s了，有人做過實驗，大鼠在60～120s之間能夠找到隱藏站臺的次數差異大約只占其找到平臺總次數的5%, 這在統計學上是“小概率事件”。也就是說, 大鼠在60s內找不到隱藏站臺的話, 再延長到120s也很難找到。而且60s還可以減小各組的標準差, 可以節約實驗時間。但問題并非如此簡單，隱蔽站臺試驗潛伏期應采用重復測量, 由于在統計時, 很多研究將*大潛伏期直接納入統計, 顯然, *大潛伏期的不同將不可避免地影響統計結果。所以從統計學上了解不同的*大潛伏期到底對Morris 水迷宮實驗結果有多大的影響, 如何避免因此帶來的系統誤差等問題尚有待進一步研究。國外文獻報道，如果水池的直徑在2m，可以設置單次訓練時間為120s,直徑在1m至1.5m,選擇訓練時間為60s, 鑒于此，我們認為訓練時間60s較為合適。時間過長，對鼠體力消耗也會過大。
2、 實驗次數：在隱藏站臺試驗中，每天訓練4次，每個象限每天只被使用一次，一定不要將大鼠連續地放入同一個象限，因為大鼠可能會憑借位置或其他非記憶信息（如向右轉彎）來定位站臺。而且，接下來每天的象限順序應當改變。在空間探索試驗中，將大鼠置于水池中追蹤120s，這個過程需要重復一次，因為在有些情況下，**實驗會觀察到一些非正常變量，可能一些老鼠在改變了實驗條件后迷失了方向。連續進行的兩次實驗計算平均值可以減少偏差，可以提供一個較高的精度和對先前學習記憶的較好控制。但是如果實驗次數多于兩次，將會導致在目的象限活動時間減少，得到不準確的空間探索結果。
3、 實驗動物：并非所有鼠株都適合于Morris迷宮測試，如近交系BALB/c小鼠不能學會該任務（成績并不隨天數的增加而進步），129/SvJ小鼠的學習成績也偏差；比如129/SvJ株的小鼠由于有年齡相關性視路病變，在衰老時完成以視覺為基礎的學習記憶任務時就會出現困難。在C57BL/6鼠，由于嚴重的禿頭癥存在，可能使某些小鼠產生抑郁，加上潰瘍性皮炎，*終可能影響小鼠的游泳能力而影響實驗成績；將動物浸入水中可能引起***或其它應激效應，后者與腦損害或藥理學操作間的相互作用具有不確定性；由于體力消耗太大，體溫也喪失過多，一些年老體弱鼠完成任務較困難，甚至會發生溺水死亡的情況；另外，個體間的成績差異也巨大，比如說，有些正常大鼠放入水中后左右觀望打圈確定方向后直接游到臺上，說明他記憶力比較好，這個現象是很重要的，有的大鼠游泳速度慢些，所以潛伏期時間比癡呆組還大。所以可以先用別的方法把大鼠初篩一下，然后再來跑水迷宮。
4、 實驗人員：實驗者應與受試動物建立良好的感情,讓動物熟悉實驗者的身體信息,如氣味、相貌等。捕捉動物的動作要溫柔,不要刺激動物。忌諱用手抓鼠的尾巴,因為這樣會極大的刺激動物。有人建議在實驗開始的兩三天之前,與鼠親密接觸。實際上鼠的嗅覺很敏感，如實驗人員為女性的話，其身上的香水味不同，都會使鼠的情緒發生變化的。
潛伏期時間為計量資料，可用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，用多個實驗組和一個對照組間均數的兩兩比較方法進行統計；對非正態或方差不齊的數據進行適當的變量轉換，待滿足正態或方差齊要求后，用轉換后的數據進行統計；若變量轉換后仍未達到正態或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統計。計數資料，比如說穿越站臺的次數，可用X2檢驗，四格表總例數小于40，或總例數等于或大于40但出現理論數等于或小于1時，應改用確切概率法。
Morris水迷宮的實驗數據較為復雜，morris水迷宮實驗準則其統計分析難度也較大，尤其是對大鼠在尋找隱蔽站臺試驗中所測得的逃避潛伏期如何進行統計學分析既往存在的問題較多。在過去的研究中，國內文獻中有的直接計算每天的平均逃避潛伏期后再進行t檢驗或方差分析，或根據大鼠的逃避潛伏期在定位航行試驗后3d趨于穩定的情況，僅對后3d的平均逃避潛伏期進行t檢驗或方差分析。有的研究則就1～5d的逃避潛伏期進行單因素方差分析。我們認為以上統計方法均不正確。一個較明顯的錯誤是，以趨于平穩的后3d的平均逃避潛伏期代表記憶水平，首先遇到的問題是僅在生理狀態下的大鼠才表現如此，而實驗記憶損傷組大鼠往往后3d的逃避潛伏期仍然持續下降。正常青年組和初老年組大鼠的逃避潛伏期在后3d趨于平穩，morris水迷宮實驗準則但實驗損傷組大鼠的逃避潛伏期由于學習記憶損傷后其基線較高，第3～5天逃避潛伏期仍然呈下降的趨勢，并不象正常對照組一樣趨于穩定。不僅如此，還存在上述統計方法對隱蔽站臺試驗中測得的逃避潛伏期數據統計學特征的認識錯誤。隱蔽站臺試驗中的逃避潛伏期具有以下特點：①系重復測量設計，即在給予某種處理后，在不同的時間點上從同一受試對象上重復測量獲得的數據(逃避潛伏期)；②影響逃避潛伏期(自變量)統計分析結果的至少有動物組別、檢測時點等多個效應因子，效應因子之間存在交互影響效應；③同一受試動物的不同時間點所測得的逃避潛伏期存在高度的自相關性；④存在截尾數據(*大潛伏期)。據此，對Morris水迷宮中隱蔽站臺試驗的逃避潛伏期應采用重復測量數據repeated measures analyses of variance(ANOVA)的多因素方差分析結合截尾數據的生存分析方法較為恰當，國外文獻報道中常用，這種方法對潛伏期均值進行進一步的分析，天數作為自變量，潛伏期或游泳速度作為因變量。
雖然文獻中提到了紛繁復雜的評價指標，但morris水迷宮實驗準則對這些指標并沒有進行很好的特征化和準則化。例如，游泳速度明顯是運動能力的指標，路徑長度又受游泳速度和游泳時間（潛伏期）的雙重影響，理論上不應該是判斷認知能力的很好指標。所以，對各項指標所反映的行為性質需要進行探討，解釋這些指標時要慎重。單用潛伏期作為指標并不能提供有關空間學習的足夠信息，因為游泳速度快也并非意味著學習效率就高，記憶能力就好。
參數定義準則：
總路程（總活動度）：實驗動物總的運動路程；
與動物自身的游泳速度直接相關，在相同的時間內，只反映動物的游泳速度的快慢；即路程越長，反映了動物的游泳速度越快。
總時間：開始錄像到錄像結束的總觀察時間；
即為單次的訓練時間，一般現在為90s;
平均速度：總路程/總時間；
從中可以看出動物游泳速度的個體差異來，動物的潛伏期和游泳速度有一定的關系；
上臺時間（潛伏期）：指實驗動物每次入水后**次成功找到站臺所需的時間；成功上臺是指在臺上逗留時間超過5～10秒鐘（可自己定義），如果逗留時間不足5～10秒，則不算上臺，潛伏期時間即為訓練時間；
潛伏期是morris水迷宮一個很重要的參照指標，它的時間長短也代表著動物空間學習記憶能力的好壞，潛伏期短，預示著動物的學習記憶能力好；但是和動物自身的游泳速度有關，比如有的正常大鼠游泳速度慢些，所以潛伏期比癡呆組動物還長，另外，某些動物放入水中后會左右觀望打圈，或者原地不動確定方向后直接游到臺上，出現這種現象，說明動物記憶力好，這個現象是很重要的，如果在**組動物發現這種情況，是非常好的。但是由于動物原地不動，這個時候潛伏期的時間可能會長，所以潛伏期并不能作為判斷記憶力好壞的*終指標。
上臺前路程：指實驗動物在**次成功上臺前所運動的路程；
與潛伏期時間相關，潛伏期時間越長，上臺前路程也就越大；二者之間呈正相關系，所以也間接反映了潛伏期時間的長短，也可以看做是評定動物記憶力好壞的指標之一。
morris水迷宮實驗準則與其他方法相比，Morris水迷宮在判定嚙齒類動物認知功能中具有很多優點：（1）它不需要實驗前訓練階段，而且可以在短時間內完成相對大量的動物。（2）由于對年齡相關性空間記憶損害有可靠的敏感性，Morris水迷宮是判斷老年鼠空間學習記憶能力的特別有用的工具。通過探測和轉移位置實驗的訓練，學習和回憶過程可以被記錄分析，也可以在各組之間比較。（3）雖然對于鼠類來說浸入水中是令其厭惡的，驅動動物逃避的是水刺激，而不需要食物剝奪和電擊，因此，避免了剝奪食物給實驗動物帶來的新陳代謝和電擊休克方面的問題，而這方面問題對某些品系的動物來說可能是危險的。（4）氣味或痕跡等干擾可以被去除。（5）將實驗動物的學習記憶障礙和感覺、運動缺陷等分離開來，減少它們對學習記憶過程檢測的干擾。可見站臺實驗，可以識別可能影響實驗結果的動物視覺缺陷，修正標準Morris水迷宮實驗中得到的結果。（6）通過改變站臺的位置，可以完成學習和再學習實驗，相應的，在同組動物中也可以測量不同用藥量的效果。（7）既可以檢測空間參考記憶又可以檢測空間工作記憶。在用固定平臺測試小鼠的空間參考記憶后再將平臺的位置改為不固定，就可檢測它們的工作記憶能力（8）通過使用窗簾、劃分區域等，可以減少實驗人員和實驗以外的物體對視頻跟蹤系統記錄的干擾。（9）能提供較多的實驗參數，系統**地考察實驗動物空間認知加工的過程，客觀地反映其認知水平，顯然，尋找不固定平臺的認知過程要復雜一些，需要動物對時間和空間上的分離信息加以整合和判斷。（10）操作簡便，數據誤差較小。
1、Morris水迷宮實驗在神經退行性**如阿爾茨海默癥（AD）和帕金森癥（PD）以及血管性癡呆（VD）等的研究方面是非常有效的：這些**的*大特征是認知功能的減退。經典的Morris水迷宮所檢測的是大鼠在多次的訓練中，學會尋找固定位置的隱蔽平臺，形成穩定的空間位置認知，這種空間認知是加工空間信息（外部線索）形成的。而平臺的位置與大鼠自身所處的位置和狀態關系不大，是一種以異我為參照點的參考認知，所形成的記憶是一種空間參考記憶。morris水迷宮實驗準則從信息的加工和提取方式來看，這種空間參考記憶進入意識系統，其儲存的機制主要涉及邊緣系統（如海馬）以及大腦皮層有關腦區，常伴有Hebb突觸修飾，應該屬于陳述性記憶。而臨床健忘和癡呆的病人，正是陳述性記憶首先受損而且比較突出。因此，Morris水迷宮實驗優選適用的范圍是以海馬損傷表現的認知功能衰退的記憶缺損。
2、神經性毒害或者****的篩選實驗：在神經藥理學和神經毒理學實驗中，某些**對神經元或者海馬等腦區有哪些毒害或者**的作用，可以用Morris水迷宮試驗檢測其對學習記憶能力的影響。如一些抗膽堿能**（如一些新的**劑）不僅抑制動物在Morris水迷宮實驗中的表現，而且在人類中也可以削弱記憶；一些擬膽堿能**（尤其是中藥里面提取的新成分）不僅可以提高動物在Morris水迷宮實驗中游泳的成績，而且可以提高人類的學習認知能力。
3、腦皮層功能衰退或意外傷害引起的工作學習記憶方面損害的實驗：Morris水迷宮實驗除了可以做隱蔽站臺實驗和探索實驗外，還可用于工作記憶的研究。比如*簡單的程序是每只大鼠每天訓練兩次。**次訓練時,平臺置于水池的任何一個象限中,并隱藏在水面下,大鼠通過游泳找到平臺,并且停留30～60 s。在**次訓練中,平臺隱藏于與**次訓練相同的位置,同樣要求大鼠通過游泳找到平臺。如果大鼠能從**次的訓練中獲得經驗(工作記憶),那么,morris水迷宮實驗準則**次訓練的成績就會提高。比較兩次實驗的成績,就可以評價工作記憶的好壞。雖然在同**的測試中,平臺的位置是相同的,但是不同天的測試中,平臺的位置是隨機的,以保證每**平臺的位置都是新的,不同于前**平臺的位置。像日常生活中的腦萎縮引起的健忘，以及車禍等意外傷害到腦皮層引起的工作學習記憶的損傷。
4、用來確定**或其他實驗處理是否導致動物視力改變：Morris水迷宮實驗還可以通過可見站臺試驗來檢測**對動物的視力是否有影響，這些視力改變會混淆動物基于遠端可見信息定位所得到數據的分析。morris水迷宮實驗準則有一點需要注意的是，某些特定的行為可能表示視力受損，比如沒有搜索行為或持續沿水池周邊游泳可能被認為是視力受損，因為動物在一段時間內并沒有定位平臺。因此動物必須試圖穿越水池而且不能準確定位站臺。
